桑葉總生物堿中1-脫氧野尻霉素的測定及方法學考察*

劉韋鋆 ，趙 駿 ，曾 森 ，劉美平

（1.天津中醫(yī)藥大學研究生，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

桑葉總生物堿中1-脫氧野尻霉素的測定及方法學考察*

劉韋鋆1，趙 駿2，曾 森2，劉美平2

（1.天津中醫(yī)藥大學研究生，天津 300193；2.天津中醫(yī)藥大學，天津 300193）

[目的]為提取純化后的桑葉總生物堿供試品中的1-脫氧野尻霉素建立測定方法及對方法學進行考察。[方法]1-脫氧野尻霉素供試品的含量測定采用柱前衍生化高效液相色譜法。[結(jié)果]制桑葉總生物堿供試品3份，經(jīng)測定，供試品中1-脫氧野尻霉素的含量分別為7.99%，8.64%，7.09%。[結(jié)論]檢測方法簡單、快速、準確。

桑葉；1-脫氧野尻霉素；柱前衍生化

桑葉，又名“鐵扇子”，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。味苦、甘，性寒，歸肺、肝經(jīng)。具有“疏散風熱，清肺潤燥，清肝明目”等功效，用于風熱感冒，肺熱燥咳，頭暈頭痛，目赤昏花[1]。有關(guān)桑葉降糖活性的機制研究認為與桑葉中的多羥基生物堿的α-糖苷酶抑制作用有密切關(guān)系[2]。本研究主要對桑葉總生物堿供試品中的1-脫氧野尻霉素進行測定，考察其方法學的可行性，為提取純化工藝優(yōu)化的研究提供監(jiān)控手段。

1 試劑、藥材、儀器

芴甲氧羰酰氯（吉爾生化上海有限公司）；1-脫氧野尻霉素對照品（中新藥業(yè)）；大孔吸附樹脂（天津市海光化工有限公司）；陽離子交換樹脂（天津市海光化工有限公司）；乙腈，甲醇（色譜純，天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司）；其余試劑均為分析純；試驗用水均為蒸餾水。桑葉藥材（購于天津市藥材公司）。RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；Waters-515型高效液相色譜儀；KDM型調(diào)溫電熱套；可剪裁型薄層層析板（天津思利達色譜技術(shù)開發(fā)公司）。

2 方法及結(jié)果

2.1 桑葉總生物堿中的1-脫氧野尻霉素的薄層鑒別 取2mg按2.3制得的供試品，加1mL甲醇溶解。取1mgL-脫氧野尻霉素對照品,加1mL甲醇溶解。分別吸取3μL供試品溶液和對照品溶液，點于薄層板上，展開劑為乙酸乙酯-無水乙醇（2∶8），展開，取出，吹干，碘熏法進行顯色，置紫外光燈（254 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。

2.2 桑葉總生物堿中1-脫氧野尻霉素的含量測定根據(jù)文獻報道[3]，1-脫氧野尻霉素的含量測定可采用柱前衍生化高效液相色譜法。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠（PhenomsilC18，250mm×4.6mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.1%冰醋酸（11∶16），檢測波長：254 nm，流速：1.0mL/min，柱溫：25℃。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱定1-脫氧野尻霉素對照品5mg，置10mL容量瓶中，加0.05mol/L鹽酸稀釋至刻度,配成濃度為0.5 g/L的1-脫氧野尻霉素對照品溶液。

2.2.3 桑葉總生物堿供試品的配制 取桑葉藥材，加蒸餾水煎煮，過濾，濾液通過大孔吸附樹脂，收集穿透部分液體，減壓濃縮，通過陽離子交換樹脂，蒸餾水洗后，用0.5mol/L氨水洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，真空干燥，即得桑葉總生物堿供試品。精密稱定桑葉總生物堿供試品30mg，加0.05mol/L鹽酸定容至10mL容量瓶中，即得供試品溶液。

2.2.4 1-脫氧野尻霉素的衍生化及測定 分別各取對照品和供試品溶液35μL，加入169μL 0.4mol/L硼酸鉀緩沖液（pH=8.5），加入250μL 5mmol/L芴甲氧羰酰氯，混勻，25℃水浴 20 min，加入 25μL 1mol/L甘氨酸、66μL 1%醋酸和162μL蒸餾水，混勻，濾過，測定峰面積。

2.2.5 1-脫氧野尻霉素（DNJ）標準曲線的制備 精密吸取1-脫氧野尻霉素標準對照品溶液分別加鹽酸配制成濃度為 0.04、0.08、0.10、0.20、0.25、0.30、0.40g/L的對照品溶液。按照2.4的方法進行衍生化反應，得峰面積分別為 333 314，595 354，743 158，1406385，1 655 477，1 953 116。以峰面積（Y）為縱坐標，1－脫氧野尻霉素對照品溶液濃度（X）為橫坐標作圖，得回歸方程：Y＝6 208 109.45X＋109 387.72，線性范圍為：0.04-0.40 g/L，相關(guān)系數(shù) r=0.999 4。

2.2.6 精密度實驗 取同一供試品衍生化后的反應液，連續(xù)進樣5次，測得峰面積的相對平均標準差（RSD）＝0.5%（n＝5），結(jié)果表明，本實驗所用儀器精密度良好。

2.2.7 重復性實驗 在2.1色譜條件下，按2.3方法平行制備5份供試品溶液，按照2.4進行衍生化反應，測定其 DNJ含量，RSD＝2.5%（n＝5），結(jié)果顯示，本方法重復性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性實驗 在2.1色譜條件下，取同一供試品衍生化后的反應液，每隔1 h進樣1次，RSD=1.8%（n=5），結(jié)果表明，供試品衍生化后在5 h內(nèi)測定比較穩(wěn)定。

2.2.9 回收率實驗 精密稱定供試品6份，分別加入DNJ對照品，在2.1色譜條件下，按照2.4進行衍生化反應，測定其DNJ含量。結(jié)果見表1。

表1 回收率的考察（n=6）Tab.1 Exam ination of recovery(n=6)

2.2.10 供試品含量測定 測定供試品峰面積，然后用標準曲線方程計算供試品中1-脫氧野尻霉素的含量，分別為7.99%，8.64%，7.09%。

3 討論

3.1 生物堿的定性鑒別 由于1-脫氧野尻霉素不易顯色，筆者先后嘗試了碘化鉍鉀顯色法、硅鎢酸顯色法、雷氏銨鹽顯色法等，顯色效果均不好。最后采用碘熏法，顯色良好。

3.2 衍生化法測定因素的考察

3.2.1 供試品自身干擾情況 將供試品衍生化前后進行比較，衍生化后，可出現(xiàn)目標峰。無衍生化的供試品在254 nm處無吸收。見圖1-3、比較后得出供試品本身在此色譜條件下對測定無干擾。

3.2.2 水浴中反應時間的考察 25℃水浴，分別反應 10、20、30、40min，峰面積為 1198 892，1 349 802，1 297 403，1 315 728?？梢娝≈蟹磻?0min，峰面積最大。故確定，水浴反應時間為20min最佳。

3.2.3 水浴溫度的考察 分別在20、25、30、35℃水浴中反應20min，峰面積為1 349 802，1 423 646，1 251 938，1 161 261?？梢?5℃時，峰面積最大。故確定，水浴溫度為25℃最佳。

3.2.4 緩沖劑pH的影響 在衍生化反應過程中，同一供試品加入pH值分別為7.99，8.19，8.50，8.61，8.78 的緩沖劑，峰面積為 496 454，527 976，543 934，542 169，539 723?？梢娋彌_劑pH值為8.5時，峰面積最大。故確定，緩沖劑pH值為8.5時最佳。

4 結(jié)論

制備桑葉總生物堿供試品3份，經(jīng)測定，1-脫氧野尻霉素的含量分別為7.99%，8.64%，7.09%。本檢測方法簡單、快速、準確。為桑葉有效組分的制備做準備，并給桑葉的綜合利用及糖尿病的預防和治療藥物的開發(fā)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1]中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典[S].北京:化學工業(yè)出版社,2005：209-209.

[2]李 宏，黃金山，胡 浩，等.桑葉對葡萄糖苷酶活力的影響及降糖機理的研究[J].中國蠶業(yè)，2003，24(2)：19.

[3]施新琴，崔為正，裘立群，等.反相高效液相色譜-紫外檢測法測定家蠶和桑葉中1-脫氧野民霉素的含量[J].全國桑樹種質(zhì)資源及育種和蠶桑綜合利用學術(shù)研討會，2005：44-51.

Study on the Measurementand Methodology of 1-deoxynojirim ycin in TotalA lkaloids from Mulberry Leaf

LIUWei-jun,ZHAO Jun,ZENGSen,etal
（Tianjin University of TCM，Tianjin 300193，China）

[Objective]To extractand purify 1-deoxynojirimycin in totalalkaloids frommulberry leafand to establish themethod of contentdetermination.[Methods]The 1-deoxynojirimycin in totalalkaloids frommulberry leafwasmeasured by using pre-column derivation high performance liquid chromatography.[Results]In thisway，the purity was exceeded above 7.99%，8.64%，7.09%.[Conclusion]Thismethod wassimple，high-speed,and accurate.

mulberry leaf;1-deoxynojirimycin in totalalkaloids;pre-column derivation

R917

A

1672-1519(2010)02-0166-03

高等學?？萍紕?chuàng)新工程重大項目培育基金項目資助課題（706013）。

劉韋鋆（1982－），男，在讀碩士研究生，主要研究方向為中藥化學。

趙 駿。

2009-11-21）