雙黃連凍干粉大鼠血清藥物成分的初步研究*

郭 潔，宋殿榮，宋紅運(yùn)，王躍飛，徐燕穎，潘桂湘

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，天津 300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，省部共建教育部方劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

雙黃連凍干粉大鼠血清藥物成分的初步研究*

郭 潔1，宋殿榮1，宋紅運(yùn)1，王躍飛2，徐燕穎1，潘桂湘2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦科，天津 300150；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，省部共建教育部方劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300193）

[目的]對(duì)雙黃連凍干粉進(jìn)行血清藥物化學(xué)分析、闡明其體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為優(yōu)化處方配伍提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。[方法]建立雙黃連凍干粉高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜，予大鼠尾靜脈注射雙黃連凍干粉，分別于10min、12 h取血，通過(guò)空白血清、含藥血清、雙黃連凍干粉HPLC指紋圖譜比對(duì)，分析雙黃連凍干粉的血清藥物成分。[結(jié)果]雙黃連凍干粉HPLC指紋圖譜中分離得到21個(gè)化合物，其中7個(gè)為已知化合物分別為：綠原酸、連翹酯苷、黃芩苷、連翹苷、木犀草素、漢黃芩苷和黃芩素；給藥后10min大鼠血清樣品中檢測(cè)到17個(gè)原形成分；12 h后可檢測(cè)到黃芩苷、木犀草素和漢黃芩苷及一未知成分。[結(jié)論]7個(gè)已知成分可能為雙黃連凍干粉體內(nèi)發(fā)揮藥效的活性成分及主要物質(zhì)基礎(chǔ)；其中黃芩苷、木犀草素和漢黃芩苷，可能對(duì)雙黃連凍干粉藥效作用的維持發(fā)揮了作用。

雙黃連凍干粉；藥效物質(zhì)基礎(chǔ)；高效液相色譜法指紋圖譜；血清藥物化學(xué)

雙黃連凍干粉是中國(guó)最早研制成功的中藥粉針劑，由金銀花、黃芩、連翹3味中藥組成，具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等作用，已廣泛應(yīng)用于臨床，治療細(xì)菌、病毒等病原體感染引起的疾病療效確切。然而隨著使用范圍越來(lái)越廣，不良反應(yīng)的報(bào)道也逐年增加。因此，本研究從雙黃連凍干粉的血清藥物成分入手，闡明體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為優(yōu)化處方配伍及新藥的二次開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料儀器與試藥

1.1 試藥與試劑 雙黃連凍干粉（SHL），規(guī)格：600 mg/支，購(gòu)自哈藥集團(tuán)中藥二廠，批號(hào)為0711010。綠原酸（110753-200413，純度>98%）、黃芩苷（(110715-200212，純度>98%）、木犀草素（111520-200205，純度>98%）、黃芩素（111595－200604，純度＞98%）對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；漢黃芩苷對(duì)照品（061012，純度≥99%）購(gòu)自上海友思生物科技公司；連翹苷、連翹酯苷對(duì)照品（純度>97%）購(gòu)自天津一方科技有限公司；試劑：乙睛（色譜純，MERCK公司），甲醇（色譜純，MERCK公司），甲酸（分析純，天津市化學(xué)試劑二廠），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 動(dòng)物 清潔級(jí)Wistar雌性大鼠，體質(zhì)量（250±10）g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所，動(dòng)物合格證號(hào) SCXK(京)2005-0013。

1.3 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀（四元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、Agilent色譜工作站）。

2 方法

2.1 雙黃連注射液的制備 取SHL（600mg/支）1支，精密加入生理鹽水6mL，超聲溶解混勻，配成濃度為100 g/L的SHL注射液備用。

2.2 雙黃連供試液的制備 稱取適量SHL，轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶，30%甲醇定容，超聲溶解，配制SHL供試溶液備用。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 稱取適量綠原酸、連翹酯苷、黃芩苷、連翹苷、木犀草素、漢黃芩苷及黃芩素對(duì)照品，30%甲醇溶解稀釋，配成混合對(duì)照品溶液。

2.4 空白血清及含藥血清樣品的制備 6只Wistar大鼠，按378mg/kg經(jīng)尾靜脈給予SHL注射液，另一組予生理鹽水1mL/次，給藥后10min、12 h取材。乙醚麻醉后，經(jīng)眼眶靜脈取血0.5mL，離心分離含藥及空白血清，-80℃冷凍備用。

2.5 空白及含藥血清樣品的處理 血清置于室溫條件下融化，取0.2mL血清，加入50μL 0.1mol/L鹽酸，渦旋 1min，加入甲醇乙腈混合液（1∶1）0.8mL，渦旋1min，室溫靜置20min，14 000 r/min離心10min，取上清液，于40℃水浴，空氣吹干。殘?jiān)?00μL流動(dòng)相復(fù)溶，渦旋2min，14 000 r/min離心10min，取上清液進(jìn)樣。

2.6 色譜條件 依利特HypersilODS2色譜柱（4.6mm×250mm,5 μm)；流動(dòng)相 A-乙腈，B-0.1%甲酸，梯度洗脫：0～10min，18%～28%A，10～20min，28%～42%A，20～25min，42%～55%A；流速 1.0mL/min；柱溫 25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm；進(jìn)樣量20μL。

3 結(jié)果

分別吸取SHL供試液、對(duì)照品溶液、含藥血清及空白血清供試液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。比較分析確定入血成分。

4 討論

SHL高效液相色譜法（HPLC）指紋圖譜中有21個(gè)共有峰，與對(duì)照品比對(duì)，7個(gè)共有峰得到歸屬，見(jiàn)表1。其中黃芩苷、連翹苷、綠原酸和木犀草素，具有較好抗菌、抗病毒作用，為中藥黃芩、連翹和金銀花質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的代表成分。連翹酯苷、黃芩素和漢黃芩苷亦有良好的抗菌、抗病毒作用。連翹酯苷是迄今為止從連翹屬植物中發(fā)現(xiàn)的抗菌活性最強(qiáng)的成分之一，為連翹的主要特征性成分，對(duì)合胞病毒、腺病毒3型和7型、柯薩奇病毒等病毒，及金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌等多種細(xì)菌具有較好的抑殺作用。因此，在評(píng)價(jià)連翹及以抗菌為主要功效的制劑質(zhì)量時(shí)以該化合物為評(píng)價(jià)指標(biāo)較為合適。黃芩的黃酮類成分是其發(fā)揮藥理活性的基礎(chǔ)，其中黃芩素和漢黃芩苷是抗菌、抗病毒的主要活性成分，也應(yīng)作為評(píng)價(jià)SHL質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的特征成分。本研究方法對(duì)SHL組方中的3味中藥金銀花、黃芩、連翹的7個(gè)藥效代表成分可進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、靈敏，可更加準(zhǔn)確、全面地反映SHL的藥效代表成分。因此，可用于對(duì)SHL質(zhì)量評(píng)價(jià)的研究。

表1 色譜峰歸屬、注射SHL后10m in、12 h大鼠血清移行成分及保留時(shí)間(m in)Tab.1 Com ponent-herb originsof themain Peak of HPLC Fingerprintand them igrating com ponentsof serum and containing time(m in)

SHL的給藥方式為靜脈注射，藥物成分直接入血，具有速效、高效的特點(diǎn)。給藥后10min，血中檢測(cè)到17個(gè)原形成分，為已歸屬的7個(gè)化合物和10個(gè)未知化合物。結(jié)合藥理作用分析，推測(cè)綠原酸、木犀草素、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、連翹苷及連翹酯苷7種已歸屬的化合物可能為SHL體內(nèi)發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，而對(duì)其余10個(gè)化合物的鑒定及藥理作用有待進(jìn)一步研究。

給藥后12 h，SHL大多數(shù)原形成分已基本消除，血清中僅檢測(cè)到4個(gè)原形成分，分別為黃芩苷、漢黃芩苷、木犀草素和一未知成分，未檢測(cè)到新的代謝產(chǎn)物。提示這4種成分在體內(nèi)存留時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，對(duì)SHL體內(nèi)藥效作用的維持可能發(fā)揮了重要作用。綠原酸大鼠體內(nèi)代謝符合靜脈注射二室開(kāi)放模型，120mg/kg給藥時(shí)生物半衰期26min[1]。按1.25、2.5、5mg/kg予大鼠靜脈注射連翹苷，分布半衰期在5～7min，生物半衰期在21～27min[2]。大鼠靜脈注射連翹酯苷50mg/kg后，血藥濃度迅速下降，體內(nèi)分布快，主要以消除過(guò)程為主，其在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)過(guò)程符合三室開(kāi)放模型[3]。黃芩素在體內(nèi)血液中發(fā)現(xiàn)的主要代謝產(chǎn)物為黃芩苷，尾靜脈注射黃芩素后，在大鼠體內(nèi)被迅速代謝成黃芩苷，30min后降至接近定量限的水平并維持8 h[4]。由此推測(cè)，給藥后12 h未檢測(cè)到綠原酸、連翹苷、連翹酯苷及黃芩素可能與其體內(nèi)代謝特點(diǎn)有關(guān)。

SHL自1992年被國(guó)家中醫(yī)藥管理局指定為全國(guó)中醫(yī)醫(yī)院急診科室必備中成藥以來(lái)，使用范圍越來(lái)越廣，也屢有不良反應(yīng)的報(bào)道。SHL引起的不良反應(yīng)約99%發(fā)生在第一次用藥過(guò)程中，其中又有約1/2至1/3發(fā)生在用藥的30min以內(nèi)[10]。本研究在給藥后10min大鼠的血清中檢測(cè)到綠原酸和黃芩苷，兩種化合物既是SHL抗菌抗病毒的有效成分，又是致敏原[11]，因此對(duì)黃芩苷、綠原酸等成分應(yīng)加強(qiáng)其療效、毒性與劑量關(guān)系研究，調(diào)整其在粉針劑中的含量，從而達(dá)到安全有效的治療效果，為優(yōu)化處方配伍及新藥的二次開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]何 心,石春偉,張?zhí)m平.雙黃連粉針中綠原酸在大白鼠中的藥物動(dòng)力學(xué)[J].中國(guó)臨床藥學(xué)雜志,1998,7(3):134-136.

[2]Yun-Xia Li,Xue-Hua Jiang,Liang Huang,et al.Determination of phillyrin in rat plasma by high-performance liquid chromatography and itsapplication to pharmacokinetic studies[J].Journal of Pharmaceuticaland Biomedical Analysis,2006 4(1):628-632.

[3]王進(jìn)東,柴秋彥,張立偉.連翹酯苷在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)學(xué)研究[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2008,10(4):53-57.

[4]劉 俊,邱利焱,金 一.RP-HPLC測(cè)定黃芩素及其代謝產(chǎn)物黃芩苷大鼠血漿濃度[J].中國(guó)藥學(xué)雜志,2007,42(12):929-931.

Study on serum active constituentsof Shuanghuanglian dry cryogen powder in rats

GUO Jie1,SONGDian-rong1*,WANGYue-fei2,etal
（1.Gynecology of the Second HospitalAffiliated to Tianjin University of TCM， Tianjin 300150， China； 2.The TraditionalChinese Medicine Research Centreof Tianjin University of TCM，key LaboratoryofPharmacology of Formulae，Ministry ofEducation，Tianjin 300193，China）

[Objective]To investigate theactive compounds in Shuanghuanglian Powder Injection(SHL)Itwasdetermined by serum pharmacochemistry for illuminating the elemental pharmacodynamic compounds and providing the foundation for optimizing the prescription of SHL.[Methods]Plasmawas obtained from Wistar rats 10min,12 h after intravenous injection of SHL.Based upon the established HPLC fingerprint of SHL,itwas compared with HPLC fingerprints of blank serum,serum containing drug and SHL.The serum active compounds in SHLwere analyzed.[Results]Twenty-one compoundswere separated by HPLC,seven compoundswere confirmed to be the SHL respectively as follow:caffeotannic acid,forsythoside,baicalin,forsythin,luteolin,wogonoside and baicalein;seventeen compoundscontained in SHLwere determined in the ratsserum afterbeing administrated with SHL for10min.Baicalin,luteolin,wogonoside and a unknown compound were determined in the serum after being administrated with SHL for 12 h.[Conclusion]The seven compounds of SHL maybe the main active compounds and the elemental pharmacodynamic compounds of SHL,Baicalin,luteolin,and wogonoside had an importanteffect inmaintaining the curative effectofSHL.

Shuanghuanglian Powder-Injection;elementalpharmacodynamic compound;HPLC fingerprint;serum pharmacochemistry

R284.2

A

1672-1519(2010)02-0160-03

國(guó)家科技部中醫(yī)藥行業(yè)資助項(xiàng)目（200707011）。

郭 潔（1982-），女，2009級(jí)博士研究生，主要研究方向?yàn)槿焉锲趹?yīng)用中藥的安全性研究。

宋殿榮。

2009-10-09）