哇巴因?qū)ρ軆?nèi)皮細胞ECV304細胞凋亡及胞內(nèi)游離鈣離子和活性氧濃度的影響

陳小義，徐忠偉，王 娜，徐瑞成

(1.武警醫(yī)學(xué)院生物學(xué)教研室，天津 300162;2.武警北京總隊第一醫(yī)院內(nèi)三科，北京 100062;3.天津市職業(yè)和環(huán)境危害生物標(biāo)志物重點實驗室，天津 300162)

內(nèi)源性哇巴因(ouabain)是由腎上腺皮質(zhì)球狀帶分泌的類固醇激素，哇巴因的異常分泌與原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，可能是高血壓發(fā)病的重要因素［1］。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，哇巴因病理濃度0.01 ～10 μmol·L－1能抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，并損傷內(nèi)皮細胞間的連接功能［2］。血管內(nèi)皮細胞是一種感覺效應(yīng)器，生理條件下能夠感受血流壓力、炎癥信號和激素水平的變化，并維持血管壁的平衡狀態(tài)［3］。內(nèi)皮損傷時，平衡狀態(tài)改變，血管壁結(jié)構(gòu)受損，這可能是導(dǎo)致高血壓發(fā)生的早期病理生理學(xué)機制。作為一種與高血壓發(fā)病密切相關(guān)的內(nèi)循環(huán)激素，哇巴因可與細胞膜上的Na+/K+-ATP酶特異性地結(jié)合，并抑制Na+/K+轉(zhuǎn)運從而發(fā)揮一系列生物學(xué)效應(yīng)［4］。目前，關(guān)于哇巴因?qū)ρ軆?nèi)皮損傷的作用機制研究較少。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304作為靶細胞，觀察哇巴因?qū)ζ浼毎婊?、細胞凋亡、細胞?nèi)游離Ca2+濃度(［Ca2+］i)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)濃度和胱天蛋白酶3表達的影響，探討哇巴因損傷血管內(nèi)皮細胞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

哇巴因，Hoechst33342和碘化丙錠(propidium iodide，PI)，Sigma公司;RPMI 1640培養(yǎng)基:Gibco公司;Fluo-3/AM熒光探針和ROS熒光探針5(6)-羧基-2'，7'-二氟二氫二乙酸熒光素〔5-(and-6)-carboxy-2'， 7'-difluorodihydrofluorescein diacetate，H2DFFDA〕，美國Molecular Probe公司;逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒，大連寶生物公司;兔抗人胱天蛋白酶3抗體:美國Santa Cruz公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗:美國KPL公司;其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 細胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304引自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細胞庫，按常規(guī)方法培養(yǎng)，以5×108L－1細胞密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，細胞生長融合度達到80%時，用胰蛋白酶/EDTA常規(guī)消化傳代。

1.3 MTT法測定細胞存活率

常規(guī)方法接種細胞于96孔板，培養(yǎng)24 h后藥物處理。實驗組分別加入哇巴因0.01，0.05，0.1，0.5，1和10 μmol·L－1，同時設(shè)正常對照組和空白對照組(只加培養(yǎng)基，不加細胞)，分別于加哇巴因后24，48和72 h加20 μl MTT(終濃度 5 g·L－1)，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，1500×g離心10 min，棄上清，每孔加150 μl DMSO，避光震蕩10 min，于波長570 nm測定各孔吸光度(A)值。按公式計算細胞存活抑制率:抑制率(%)=(A正常對照－A實驗)/(A正常對照－A空白對照)×100%。

1.4 Hoechst33342/PI雙熒光染色法檢測細胞凋亡百分率

ECV304細胞于對數(shù)生長期常規(guī)消化傳代，調(diào)整細胞密度為5×108L－1，接種于75 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，設(shè)正常對照組和哇巴因?qū)嶒灲M。實驗組為哇巴因0.1，1 和10 μmol·L－1作用 24 h，哇巴因 0.1 μmol·L－1作用48 h，常規(guī)消化，離心收集細胞，棄上清液，將細胞重懸于200 μl PBS中，加入 Hoechst33342和 PI各 20 μl(終濃度分別為 10 和 50 mg·L－1)，在 37℃孵箱染色10 min，1000×g離心10 min，棄上清，加入適量PBS，吹打混勻，滴片，在熒光顯微鏡下觀察。正常細胞被Hoechst33342染成藍色熒光，細胞形態(tài)規(guī)整，細胞核較大;凋亡細胞呈現(xiàn)形態(tài)不規(guī)則、核染色質(zhì)凝集和核膜破裂等凋亡特征;壞死細胞被PI染成紅色熒光，屬凋亡后期細胞。每組細胞取3張玻片，每張隨機選取6個200倍視野，計數(shù)正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞，并計算正常細胞、凋亡細胞和壞死細胞百分率。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡百分率

取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化傳代，調(diào)整細胞密度為5×108L－1，接種于75 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)24 h后，加入哇巴因 0.1 μmol·L－1分別作用 24 和 48 h，同時設(shè)培養(yǎng)基對照組，離心，PBS洗滌，75%冰乙醇4℃固定過夜，RNA 酶250 mg·L－137℃孵育30 min，PI 50 mg·L－1染色 30 min，上機前 300 目尼龍網(wǎng)過濾。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長530 nm，檢測細胞凋亡百分率。

1.6 激光共聚焦顯微鏡測定細胞內(nèi)游離Ca2+濃度

取對數(shù)生長期細胞，以1×107L－1密度接種于Confocal專用小平皿中，24 h后加入哇巴因0(正常對照)，0.01，0.1 和 0.5 μmol·L－1分別作用 12，24和36 h后，PBS洗 2次，加入 100 μl H2DFFDA 5 μmol·L－1，37℃ 避光溫育 45 min，激光共聚焦顯微鏡測定［Ca2+］i，激發(fā)光波長為488 nm，檢測波長為530～560 nm。

1.7 細胞內(nèi)活性氧濃度的測定

實驗分組同1.6，用H2DCF-DA標(biāo)記ROS自由基，加入 100 μl H2DFFDA 5 μmol·L－1，37℃ 避光溫育45 min，激光共聚焦顯微鏡測定細胞內(nèi)ROS濃度。激發(fā)光波長為 488 nm，檢測波長為530～560 nm。

1.8 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測胱天蛋白酶3 mRNA的表達

哇巴因0(正常對照)，0.01，0.1 和0.5 μmol·L－1加入細胞作用24 h后，收集細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄具體步驟參考PrimeScriptTMRT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書。PCR反應(yīng)體系:cDNA 10 μl，5 ×PCR緩沖液 10 μl，DNA 聚合酶(TaqTMHS)0.25 μl，上游引物 1.0 μl，下游引物 1.0 μl。胱天蛋白酶3引物:上游，5'-GTGGAATTGATGCGTGATG-3'，下游，5'-GGAATCTGTTTCTTTGCATG-3'，擴 增 產(chǎn) 物499 bp;β肌動蛋白:上游，5'-TGTTTGAGACCTTCAACACCC-3'，下游，5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'，擴增產(chǎn)物540 bp。反應(yīng)條件:94℃ 2 min，94℃ 30 s，55℃ 1 min，72℃延伸 1 min;擴增 30 循環(huán);72℃延伸10 min。反應(yīng)完成后取10 μl擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠上電泳。用凝膠自動成像系統(tǒng)掃描，以β肌動蛋白為內(nèi)參照，以胱天蛋白酶3與β肌動蛋白灰度值的比值表示胱天蛋白酶3 mRNA相對表達水平。

1.9 Western印跡法檢測胱天蛋白酶3蛋白的表達

哇巴因0(正常對照)，0.01，0.1 和0.5 μmol·L－1加入細胞24 h后收集細胞，200 μl細胞裂解液，冰上裂解60 min，15 000×g離心，BCA法測定上清液中蛋白質(zhì)濃度。上樣蛋白質(zhì)50 μg，進行SDS-PAGE電泳，伯樂半干轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，加入兔抗人胱天蛋白酶3一抗(1∶200)，4℃孵育過夜，用含0.05%吐溫20的Tris緩沖液洗3次，每次15 min;用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗(1∶4000)37℃孵育2 h，用含0.05%吐溫20 的Tris緩沖液洗3次，將膜置于暗盒中，壓片曝光，顯影，定影。Bandscan 5.0軟件分析各條帶的積分吸光度(integrated absorbance，IA)值，以 IA胱天蛋白酶3/IAβ肌動蛋白值表示胱天蛋白酶3蛋白的相對表達水平。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 哇巴因?qū)?ECV304細胞存活的影響

由表1 可見，哇巴因在0.01 ～10 μmol·L－1濃度范圍內(nèi)與ECV304細胞分別作用24，48和72 h，對細胞存活抑制率明顯增加，且呈濃度和時間依賴性，24，48和72 h濃度-效應(yīng)相關(guān)系數(shù)分別為 0.984，0.994和0.997(P ＜0.05);24，48 和 72 h 哇巴因的IC50值分別為 0.624，0.184 和 0.041 μmol·L－1，時間-效應(yīng)相關(guān)系數(shù)為0.974(P ＜0.05)。

2.2 哇巴因?qū)CV304細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果(圖1)表明，正常對照組24和48 h細胞凋亡百分率分別為(4.2±0.5)% 和(4.7 ±0.5)%，哇巴因0.1 μmol·L－1作用 ECV304 細胞24和48 h，細胞周期G0/G1前出現(xiàn)亞二倍體峰，細胞凋亡百分率分別為(26.0±3.2)% 和(36.5±5.3)%，與對照組比較明顯升高(n=3，P ＜0.01)。

如圖2和圖3結(jié)果所示，正常對照組細胞被Hoechst33342染成藍色熒光，細胞形態(tài)規(guī)整，細胞核較大。哇巴因 0.1 μmol·L－1與細胞作用 24 h 可誘導(dǎo)細胞凋亡，部分細胞呈核染色質(zhì)凝集、藍染的凋亡形態(tài);哇巴因 1 μmol·L－1可誘導(dǎo)細胞凋亡和壞死;哇巴因 10 μmol·L－1細胞大量壞死。哇巴因 0.1 μmol·L－1作用48 h，細胞凋亡數(shù)量明顯增加，其中紅染但染色質(zhì)凝集細胞為凋亡后期細胞。

表1 哇巴因?qū)CV304細胞存活的影響Tab.1 Effect of ouabain on ECV304 cell survival

圖1 流式細胞儀分析哇巴因與ECV304細胞作用24(A)和48 h(B)對細胞凋亡的影響.1:正常對照;2:哇巴因0.1 μmol·L－1.Fig.1 Effect of ouabain on apoptosis of ECV304 cells incubated for 24(A)and 48 h(B)detected by flow cytometry.

圖2 哇巴因與ECV304細胞作用24 h對細胞凋亡的影響 (Hoechst33342 ×200).A:正常對照組;B，C和D:分別為哇巴因0.1，1 和10 μmol·L－1組.箭頭示凋亡細胞.Fig.2 Effect of ouabain on apoptosis of ECV304 cells incubated for 24 h(Hoechst33342 ×200).

圖3 哇巴因與ECV304細胞作用24(A)和48 h(B)對細胞凋亡的影響 (Hoechst33342×200).1:正常對照組;2:哇巴因0.1 μmol·L －1組.箭頭示凋亡細胞.Fig.3 Effect of ouabain on apoptosis of ECV304 cells incubated for 24(A)and 48 h(B)(Hoechst33342 ×200).

2.3 哇巴因?qū)CV304細胞內(nèi)游離Ca2+和活性氧濃度的影響

圖4及表2和圖5及表3結(jié)果表明，哇巴因0.01，0.1 和 0.5 μmol·L－1分別與 ECV304 細胞作用12，24 和36 h，［Ca2+］i和 ROS 濃度呈濃度和時間依賴性增加，在哇巴因 0.5 μmol·L－1時［Ca2+］i和ROS濃度的時間-效應(yīng)相關(guān)系數(shù)分別為0.912和0.924(P ＜0.05)，作用 36 h 時［Ca2+］i和 ROS 濃度的濃度-效應(yīng)相關(guān)系數(shù)分別為0.889和0.907(P ＜0.05)。

圖4 激光共聚焦顯微鏡檢測哇巴因與ECV304細胞作用12(A)，24(B)和36 h(C)對細胞內(nèi)游離鈣離子濃度(［Ca2+］i)的影響 (×100).1:正常對照;2:哇巴因0.01 μmol·L－1;3:哇巴因0.1 μmol·L－1;4:哇巴因0.5 μmol·L－1.Fig.4 Effect of ouabain on concentration of intracellular free calcium ion(［Ca2+］i)in ECV304 cells incubated for 12(A)，24(B)and 36 h(C)detected by laser confocal microscope(×100).

圖5 激光共聚焦顯微鏡檢測哇巴因與ECV304細胞作用12(A)，24(B)和36 h(C)對細胞內(nèi)活性氧(ROS)濃度的影響(×200).1:正常對照;2:哇巴因0.01 μmol·L －1;3:哇巴因 0.1 μmol·L －1;4:哇巴因 0.5 μmol·L－1.Fig.5 Effect of ouabain on reactive oxygen species(ROS)concentration in ECV304 cells incubated for 12(A)，24(B)and 36 h(C)detected by laser confocal microscope(×200).

表2 哇巴因?qū)CV304細胞內(nèi)鈣離子濃度(［Ca2+］i)的影響Tab.2 Effect of ouabain on intracellular calcium ion concentration(［Ca2+］i)in ECV304 cell

表3 哇巴因?qū)CV304細胞內(nèi)活性氧(ROS)濃度的影響Tab.3 Effect of ouabain on reactive oxygen species(ROS)in ECV304 cell

2.5 哇巴因?qū)CV304細胞胱天蛋白酶3表達的影響

圖6 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測哇巴因與ECV304細胞作用24 h對胱天蛋白酶3 mRNA表達的影響.用胱天蛋白酶3與β肌動蛋白條帶灰度比值表示胱天蛋白酶3 mRNA相對表達水平.A:條帶1 ～4，哇巴因0，0.01，0.1 和0.5 μmol·L－1組;條帶5 ～8，哇巴因0，0.01，0.1和0.5 μmol·L－1組;M:標(biāo)志物.B:定量分析結(jié)果.±s，n=3.*P ＜0.05，與 0 μmol·L－1組比較.Fig.6 Effect of different concentrations of ouabain on caspase 3 mRNA expression in ECV304 cells incubated for 24 h detected by RT-PCR.

逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果(圖6)顯示，與正常對照組相比，哇巴因 0.01 μmol·L－1與 ECV304 細胞作用 24 h，胱天蛋白酶3 mRNA表達無明顯變化，哇巴因0.1和 0.5 μmol·L－1作用24 h，胱天蛋白酶 3 mRNA 表達明顯增加(P＜0.05)。Western印跡法結(jié)果(圖7)顯示，與正常對照組相比，哇巴因 0.01，0.1和0.5 μmol·L－1與 ECV304 細胞作用 24 h 胱天蛋白酶3蛋白表達明顯增加(P＜0.05)。

圖7 Western印跡法檢測不同濃度哇巴因與ECV304細胞作用24 h對胱天蛋白酶3蛋白表達的影響.A:條帶1～4，哇巴因0，0.01，0.1 和0.5 μmol·L－1;B:定量分析結(jié)果.IA:積分吸光度.±s，n=3.*P＜0.05，與0 μmol·L－1組比較.Fig.7 Effect of ouabain on caspase 3 protein expression in ECV304 cells incubated for 24 h detected by Western blotting.

3 討論

外源性哇巴因(毒毛花苷G，strophantin G)來源于植物夾竹桃苷，為哺乳動物細胞膜表面Na+/K+-ATPase的天然抑制因子。近年來，在動物和人體內(nèi)檢測到一種由腎上腺皮質(zhì)分泌的類固醇激素，被命名為內(nèi)源性哇巴因，兩者的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)均相同［5］。研究表明，內(nèi)源性哇巴因與原發(fā)性和繼發(fā)性高血壓等心血管疾病密切相關(guān)。因此，哇巴因的潛在功能成為目前的研究熱點。Manunta等［6］提出長期高血壓可以引起血管內(nèi)皮細胞不可逆性損傷，導(dǎo)致血管重塑及靶器官功能障礙。因此，血管內(nèi)皮細胞功能損傷與心血管疾病發(fā)病機制之間的聯(lián)系更為人所關(guān)注。本研究在前期內(nèi)源性洋地黃物質(zhì)與心血管疾病關(guān)系的研究基礎(chǔ)上，重點探討外源性哇巴因?qū)θ搜軆?nèi)皮細胞凋亡的影響及其作用機制。

哇巴因?qū)毎L的調(diào)節(jié)是多向的，不同濃度的哇巴因?qū)Σ煌毎淖饔貌煌?。任延平等?］報道，哇巴因 0.001 μmol·L－1能刺激人血管內(nèi)皮細胞增殖，而在病理濃度(0.01 ～1 μmol·L－1)下引起細胞凋亡，通過直接造成內(nèi)皮損傷而啟動高血壓血管重塑，進一步加重繼發(fā)的靶器官損傷。本課題組綜合前期研究結(jié)果，即哇巴因作用后，血管內(nèi)皮細胞出現(xiàn)細胞腫脹和細胞器溶解等壞死特征，同時亦具有諸如染色質(zhì)凝集和胱天蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)等凋亡特征，因此提出Na+/K+-ATP酶抑制后能夠同時引起細胞凋亡和壞死，此現(xiàn)象稱之為雜合性細胞死亡(hybrid cell death)［8］。Xiao 等［9］將哇巴因作用于培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)在細胞腫脹之后可出現(xiàn)細胞皺縮，同時伴隨約80%細胞K+流失，提示細胞內(nèi)生理濃度K+具有抑制凋亡的作用，細胞內(nèi)K+濃度穩(wěn)態(tài)改變可能也是觸發(fā)凋亡的始動因素之一。也有報道認(rèn)為，細胞內(nèi)Na+濃度升高以及Ca2+超載對凋亡的發(fā)生也有重要的調(diào)節(jié)作用［10］。

Na+/K+-ATP酶是一類跨膜蛋白，由2～4個α和β亞基組成，α亞基是催化亞單位分為α1～α4亞型，β亞基是調(diào)節(jié)亞單位分為β1～β3亞型，α亞單位上分布著陽離子、ATP和Na+/K+-ATP酶抑制劑的結(jié)合位點［11－12］。Na+/K+-ATP 酶不僅維持細胞內(nèi)高K+和低Na+濃度的離子平衡狀態(tài)，亦作為洋地黃物質(zhì)信號傳遞受體，激活Src家族激酶，偶聯(lián)表皮生長因子受體;募集調(diào)節(jié)蛋白Shc，將洋地黃信號傳遞至Ras-Raf-絲裂原激活蛋白激酶途徑，形成級聯(lián)反應(yīng)［4］。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著哇巴因濃度的增加和作用時間的延長，其對ECV304細胞存活的抑制作用逐漸增強;哇巴因不同濃度對細胞凋亡特征的影響有所不同，哇巴因 10 μmol·L－1對細胞存活具有明顯的抑制作用，24 h后引起細胞壞死，PI透過破損的細胞膜，將細胞染成紅色，且染色質(zhì)不出現(xiàn)凝集;哇巴因 0.1 μmol·L－1可誘導(dǎo) ECV304 細胞凋亡，凋亡細胞的細胞膜完整，核藍染，染色質(zhì)呈亮珠狀凝集。此外，哇巴因可增加 ECV304細胞［Ca2+］i及 ROS濃度，并呈濃度-時間依賴性。其機制可能有以下幾個方面:①哇巴因抑制Na+/K+-ATP酶活性，細胞內(nèi)外Na+-K+交換降低，細胞內(nèi)Na+積聚，引起細胞膜去極化，激活電壓依賴式Ca2+通道，大量Ca2+進入細胞;②細胞內(nèi)Na+含量升高，細胞內(nèi)外Na+-Ca2+代償性交換增加，［Ca2+］i增加［13］;③Na+/K+-ATP酶本身就與Ca2+轉(zhuǎn)運相關(guān)，Na+/K+-ATP酶被抑制后，細胞內(nèi)ATP分解減少，含量增加，ATP激活蛋白激酶使Na+/K+-ATP酶磷酸化，致細胞膜對Ca2+通透性增加和細胞內(nèi)結(jié)合鈣釋放［13］;另有報道，Na+/K+-ATP酶抑制后可激活絲裂原激活蛋白激酶信號途徑，后者使L型Ca2+通道蛋白磷酸化，導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流，使［Ca2+］i升高［14］。ROS 可損傷各種膜性細胞器和DNA分子，是引起細胞凋亡的重要介質(zhì)。細胞內(nèi)ROS濃度增加，可能與Na+/K+-ATP酶受抑制后細胞內(nèi)線粒體膜電位發(fā)生變化，線粒體出現(xiàn)腫脹，糖酵解程度降低，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)即還原型輔助酶Ⅱ生成減少有關(guān)。NADPH是維持谷胱甘肽過氧化物酶/還原酶與硫氧還原蛋白活性所必須的物質(zhì)，后兩者對清除細胞內(nèi) ROS起著重要作用［15］。另外，哇巴因作用ECV304細胞后還可引起ECV304細胞的胱天蛋白酶3表達增加，表明Na+/K+-ATP酶受抑制后可導(dǎo)致Ca2+和ROS含量增加，并引起繼發(fā)性的線粒體膜電位變化，最終線粒體破裂釋放大量細胞色素c，進而增加胱天蛋白酶3表達誘導(dǎo)細胞凋亡;同時Chueh 等［16］報道，哇巴因 5 μmol·L－1可誘導(dǎo)人平滑肌細胞同時發(fā)生細胞凋亡和壞死，在此過程中可檢測到胱天蛋白酶3的活化。

總之，哇巴因抑制血管內(nèi)皮細胞Na+/K+-ATP酶引起細胞［Ca2+］i和ROS濃度升高，同時伴隨胱天蛋白酶3表達增加可能是引起血管內(nèi)皮細胞損傷的直接原因，其作用機制有待進一步研究。

［1］ Balzan S，Nicolini G，Iervasi A，Di Cecco P，F(xiàn)ommei E.Endogenous ouabain and acute salt loading in lowrenin hypertension［J］.Am J Hypertens，2005，18(7):906-909.

［2］ 徐瑞成，王 娜，徐忠偉，陳雪芬，呼文亮.哇巴因抑制鈉泵β1亞單位和VE-cadherin減弱血管內(nèi)皮細胞連接功能［J］.中國藥理學(xué)通報，2008，24(8):1093-1098.

［3］ Tripodi G， Citterio L， Kouznetsova T， Lanzani C，F(xiàn)lorio M，Modica R，et al.Steroid biosynthesis and renalexcretion in human essential hypertension:association with blood pressure and endogenous ouabain［J］.Am J Hypertens，2009，22(4):357-363.

［4］ Xie Z，Cai T.Na+-K+-ATPase-mediated signal transduction:from protein interaction to cellular function［J］.Mol Interv，2003，3(3):157-168.

［5］ Pierre SV，Yang C，Yuan Z，Seminerio J，Mouas C，Garlid KD， et al.Ouabain triggers preconditioning through activation of the Na+，K+-ATPase signaling cascade in rat hearts［J］.Cardiovasc Res，2007，73(3):488－496.

［6］ Manunta P，Stella P，Rivera R，Ciurlino D，Cusi D，F(xiàn)errandi M，et al.Left ventricular mass，stroke volume，and ouabain-like factor in essential hypertension［J］.Hypertension，1999，34(3):450-456.

［7］ 任延平，呂卓人.哇巴因?qū)w外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞的作用［J］.高血壓雜志，2003，11(6):599-603.

［8］ 徐瑞成，張 敏.哇巴因信號的傳遞及其對細胞生長和死亡的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2005，21(2):149-152.

［9］ Xiao AY，Wang XQ，Yang A，Yu SP.Slight impairment of Na+，K+-ATPase synergistically aggravates ceramideand beta-amyloid-induced apoptosis in cortical neurons［J］.Brain Res，2002，955(1-2):253-259.

［10］ Orlov SN，Thorin-Trescases N，Pchejetski D，Taurin S，F(xiàn)arhat N，Tremblay J，et al. Na+/K+pump and endothelial cell survival:［Na+］i/［K+］i-independent necrosis triggered by ouabain，and protection against apoptosis mediated by elevation of［Na+］i.Pflugers Arch，2004，448(3):335-345.

［11］ Ogawa H，Shinoda T，Cornelius F，Toyoshima C.Crystal structure of the sodium-potassium pump(Na+，K+-ATPase)with bound potassium and ouabain［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106(33):13742-13747.

［12］ Horisberger JD.Recent insights into the structure and mechanism ofthesodium pump［J］. Physiology(Bethesda)，2004，19:377-387.

［13］ Shpak B，Gofman Y，Shpak C，Hiller R，Boyman L，Khananshvili D.Effects of purified endogenous inhibitor of the Na+/Ca2+exchanger on ouabain-induced arrhythmias in the atria and ventricle strips of guinea pig［J］.Eur J Pharmacol，2006，553(1-3):196-204.

［14］ Iwamoto T，Kita S.Hypertension，Na+/Ca2+exchanger，and Na+，K+-ATPase［J］.Kidney Int，2006，69(12):2148-2154.

［15］ Mikhaǐlov VF， Mazurik VK， Burlakova EB. Signal function of the reactive oxygen species in regulatory networks of the cell reaction to damaging effects:contribution of radiosensitivity and genome instability［J］.Radiats Biol Radioecol，2003，43(1):5-18.

［16］ Chueh SC，Guh JH，Chen J，Lai MK，Teng CM.Dual effects of ouabain on the regulation of proliferation and apoptosis in human prostatic smooth muscle cells［J］.J Urol，2001，166(1):347-353.