聯(lián)合使用氨基葡聚糖和硫酸軟骨素抗炎鎮(zhèn)痛作用實(shí)驗(yàn)研究

楊春燕 韓剛 王錦程 原海忠 董月 翟冠鈺 范穎康英

1唐山市第二醫(yī)院（唐山 063000） 2華北煤炭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系 3唐山容大藥業(yè)有限公司

氨基葡聚糖（glucosamine，GS）和硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）屬于天然氨基多糖類化合物［1］，兩者易溶于水，易吸收，可以通過血液－滑膜屏障覆蓋并分散至關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)，能夠被軟骨細(xì)胞吸收［2］。氨基葡聚糖和硫酸軟骨素在關(guān)節(jié)軟骨中更易與水結(jié)合，保持關(guān)節(jié)腔潤滑和緩沖壓力，對受損的軟骨細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。氨基葡聚糖和硫酸軟骨素可控制和改善骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）癥狀，修復(fù)軟骨組織［3］。多項(xiàng)臨床隨機(jī)雙盲實(shí)驗(yàn)中，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的患者服用氨基葡聚糖，對照服用安慰劑治療，結(jié)果患者的膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動受限癥狀明顯減輕［4］。近年來，有關(guān)氨基葡聚糖和硫酸軟骨素單獨(dú)與聯(lián)合使用治療骨性關(guān)節(jié)炎的報道較多［5,6］。對于聯(lián)合使用氨基葡聚糖和硫酸軟骨素抗炎和鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究報道較少。本實(shí)驗(yàn)以大鼠和小鼠為動物模型，研究聯(lián)合使用氨基葡聚糖和硫酸軟骨素抗炎和鎮(zhèn)痛作用，為探討聯(lián)合使用氨基葡聚糖和硫酸軟骨素改善OA癥狀作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SD大鼠，SPF級，雄性，體重150～180g；ICR小鼠SPF級，雄性，體重 18～22g，許可證編號：SCXK（京）20060330，動物飼養(yǎng)設(shè)施許可證編號：SYXK（冀）2005-0038。

1.2 藥品

角叉菜膠膠（遼寧省藥物研究所）；阿斯匹林（石家莊康利藥業(yè)有限公司，批號：080724）；氨基葡聚糖和硫酸軟骨素（唐山容大藥業(yè)有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠足腫脹試驗(yàn)［7］

SD大鼠100只隨機(jī)分為10組，每組10只，分別為正常對照組（14天組、28天組）、阿斯匹林陽性藥物組14天組、28天組）、聯(lián)合使用GS和CS低劑量組（14天組、28天組）、中劑量組（14天組、28天組）、高劑量組（14天組、28天組）。

給藥時，氨基葡聚糖和硫酸軟骨素的質(zhì)量比為5∶4［8］。經(jīng)口灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥14天和28天。正常對照組給予蒸餾水灌胃。

在給藥第14天和第28天，各組大鼠均于左后足趾中部皮下注射1%角叉菜膠0.1ml。分別于致炎1、4和6h用千分卡尺測量足趾厚度（右后足作為對照），計算左右足趾厚度差（足趾腫脹度）。

1.3.2 炎癥因子PGE2含量的測定

另取正常大鼠10只，與給藥14天組同時同劑量注射角叉菜膠作為模型組，另取給藥14天、致炎6h各組大鼠，測量足趾腫脹度后立即處死，取炎癥足，剪開皮膚后浸入1.5ml生理鹽水中，反復(fù)擠壓洗出炎癥滲出液，3000r/min離心，取上清液 140μl，加入 2ml 0.15mol/L氫氧化鉀－甲醇溶液，混勻，50℃水浴20min，取出稍冷后加入5ml甲醇稀釋，在278nm處測定吸光度值A(chǔ)。

1.3.3 大鼠肉芽腫實(shí)驗(yàn)［7］

雄性SD大鼠50只，大鼠乙醚吸入麻醉，在無菌條件下，將重量為20mg的滅菌棉球，植入大鼠兩側(cè)腹股溝皮下，縫合皮膚，大鼠飼養(yǎng)于室溫20～24℃、濕度45%～65%的屏蔽環(huán)境。術(shù)后動物隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為正常對照組、阿斯匹林陽性藥物組、同1.3.1項(xiàng)方法設(shè)低劑量組、中劑量組、高劑量組。大鼠灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥30天。末次給藥禁食不禁水10h后，麻醉處死動物，摘出棉球與肉芽組織，稱濕重，于70℃干燥24h，稱干重。干重減去棉球重量即為肉芽腫凈重，肉芽腫增生系數(shù)為肉芽腫重量。

1.3.4 醋酸致小鼠扭體反應(yīng)試驗(yàn)［7］

ICR小鼠60只，按預(yù)篩潛伏期隨機(jī)分為5組，每組12只，分別為正常對照組、阿斯匹林陽性藥物組、同1.3.1項(xiàng)方法設(shè)低劑量組、中劑量組、高劑量組。經(jīng)口灌胃給藥，每天1次，連續(xù)給藥28天。在給藥第28天，于給藥后30min，各組動物均腹腔注射0.6%醋酸溶液（1.3ml/kg），記錄15min內(nèi)小鼠“扭體”次數(shù)。將小鼠給藥后的扭體次數(shù)與正常對照組比較。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用SPSS 12.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)值采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析及兩兩比較的q檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05認(rèn)為有顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 足趾腫脹度

表1顯示，給藥14天，注射角叉菜膠4h，阿司匹林組，聯(lián)合使用GS和CS中、高劑量組足趾腫脹度明顯小于正常對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；注射角叉菜膠6h，低、中、高劑量組足趾腫脹度明顯小于正常對照組，具有顯著性差異（P<0.05）。

給藥28天，與正常對照組比，低、中、高劑量組足趾腫脹度明顯下降（P<0.05）。與阿司匹林陽性藥物組比，低、中、高劑量組大鼠足趾腫脹度無顯著性差異（P>0.05）。

表1 給藥14天和28天大鼠足趾腫脹度（mm）

2.2 PGE2含量

表2顯示，與模型組比，阿司匹林陽性藥物組，聯(lián)合使用GS和CS低、中、高劑量組炎癥滲出液中炎癥因子PGE2水平顯著降低（P<0.05）。

表2 給藥14天大鼠炎癥滲出液PGE2含量比較

2.3 大鼠肉芽腫凈重

表3顯示，阿司匹林陽性藥物組，聯(lián)合使用GS和CS低、中、高劑量組大鼠肉芽腫凈重顯著低于正常對照組（P<0.01），與阿司匹林陽性藥物組比，聯(lián)合使用GS和CS低、中、高劑量組無顯著性差異（P>0.05）。

表3 給藥30天各組大鼠肉芽腫凈重比較

2.4 醋酸致小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表4顯示，與正常對照組比，給藥28天，阿司匹林陽性藥物組，低、中、高劑量組醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)均顯著下降（P<0.05）。

表4 給藥28天醋酸致小鼠扭體反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

大鼠足趾腫脹實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的動物急性炎癥模型，可用于抗急性炎癥的評價。本實(shí)驗(yàn)中，給藥28天，與正常對照組比較，聯(lián)合使用GS和CS（低、中、高劑量）均能明顯抑制角叉菜膠致大鼠急性炎癥。棉球植入法致大鼠肉芽腫是經(jīng)典的致慢性炎癥模型，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，聯(lián)合使用GS和CS可顯著抑制大鼠肉芽腫的形成，對慢性炎癥有抑制作用。聯(lián)合使用GS和CS（低、中、高劑量）均能對醋酸致小鼠扭體反應(yīng)產(chǎn)生明顯的抑制作用，表明聯(lián)合使用GS和CS有鎮(zhèn)痛作用。與阿司匹林療效比較，聯(lián)合使用GS和CS（低、中、高劑量）無顯著性差異。

有研究表明［9］，對于OA，聯(lián)合使用GS和CS可通過抑制關(guān)節(jié)組織中多種炎癥介質(zhì)和氧自由基的產(chǎn)生，起到抗炎和鎮(zhèn)痛作用。炎癥介質(zhì)是一種參與炎癥反應(yīng)具有生物活性的化學(xué)物質(zhì)，在炎癥發(fā)展過程中，PGE2是一種重要的炎癥介質(zhì)，可引起血管擴(kuò)張，血管壁通透性升高，引起發(fā)熱或致痛［10］。本實(shí)驗(yàn)中，與模型組比較，聯(lián)合使用GS和CS時，能顯著降低炎癥組織PGE2含量，這說明聯(lián)合使用GS和CS能抑制炎癥組織PGE2的合成與釋放，從而產(chǎn)生抗炎作用。

氨基葡聚糖和硫酸軟骨素為天然高分子，無毒無副作用。聯(lián)合使用氨基葡聚糖和硫酸軟骨素可緩解骨性關(guān)節(jié)炎及關(guān)節(jié)炎引起的疼痛。本研究通過動物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了聯(lián)合使用氨基葡聚糖和硫酸軟骨素具有抗急性炎癥和慢性炎癥及鎮(zhèn)痛作用，也為氨基葡聚糖和硫酸軟骨素復(fù)方制劑的開發(fā)提供了依據(jù)［11］。

［1］Dahmer S，Schiller RM.Glucosamine.Am Fam Physician，2008，78（4）：471-476.

［2］Lee YH，Woo JH，Choi SJ.Effect of glucosamine or chon droitin sulfate on the osteoarthritis progression：a meta-analysis.Rheumatol Int，2010，30（3）：357-363.

［3］Bruyere O，Pavelka K，Rovati LC，et al.Total joint replace ment after glucosamine sulfate treatment in knee osteoarthritis：Resultsof a mean 8-year observation of patients from two previous3-year，randomized，placebo-controlled trials.2008，16（2）：254-260.

［4］Poolsup N，Suthisisang C，Channark P，et al.glucosamine long-term treatment and the progression of knee osteoarthritis：systematic review of randomized controlled trials.Ann Pharmacother，2005，39（6）：1080-1087.

［5］Bruyere O，Reginster JY.Glucosamine and chondroitin sulfate as therapeutic agents for knee and hip osteoarthritis.Drugs Aging，2007，24（7）：573-580.

［6］Silva FS Jr，Yoshinari NH，Castro RR，et al.Combined glucosamine and chondroitin sulfate provides functional and structural benefit in the anterior cruciate ligament transection model.Clin Rheumatol，2009，28（2）：109-117.

［7］徐叔云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，2001.911-913.

［8］傅欣，林霖，魏學(xué)磊，等.氨基葡萄糖和硫酸軟骨素聯(lián)合用藥對兔骨關(guān)節(jié)炎治療作用實(shí)驗(yàn)研究.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2008，27（5）：588-592.

［9］Chan PS，Caron JP，Rosa GJ，et al.Glucosamine and chondroitin sulfate regulate gene expression and synthesis nitric oxide and prostaglandin E in articular cartilage explants.Osteoarthritis Cartilage，2005，13（5）：387-394.

［10］盧亮宇，王予彬.膝骨關(guān)節(jié)炎疼痛機(jī)制及治療研究現(xiàn)狀.中國運(yùn)動醫(yī)學(xué)雜志，2007，26（7）：512-516.

［11］郭亭，趙建寧.氨基葡聚糖和硫酸軟骨素在治療骨性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用. 中國骨傷，2004，17（9）：574-575.