一次大強(qiáng)度運(yùn)動后大鼠骨骼肌收縮蛋白降解和26S蛋白酶體活性的變化

朱榮 馬延超 許壽生 王瑞元

1溫州醫(yī)學(xué)院（浙江 溫州 325035） 2洛陽師范學(xué)院 3北京體育大學(xué)

我們實(shí)驗(yàn)室的前期研究證實(shí)：大負(fù)荷運(yùn)動后骨骼肌收縮蛋白（actin、myosin）、細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白（desmin、titin、nebulin）、膜骨架蛋白（dystrophin、integrin）含量減少，超微結(jié)構(gòu)改變（表現(xiàn)為Z線扭曲、模糊、肌絲排列紊亂等），肌力減弱，發(fā)現(xiàn)這與蛋白質(zhì)的溶酶體、calpain降解途徑活性增強(qiáng)有關(guān)［1-3］，而細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)降解主要途徑——泛素蛋白酶體途徑的變化如何呢？國內(nèi)外研究不多。本實(shí)驗(yàn)通過觀察大鼠一次大強(qiáng)度運(yùn)動后腓腸肌3-MH含量、26S蛋白酶體活性及其亞基C2 mRNA表達(dá)的變化，初步探討泛素蛋白酶體途徑在運(yùn)動骨骼肌蛋白質(zhì)降解的作用。

1 材料與方法

1.1 動作與分組

雄性 SPF級 Sprague-Dawley大鼠 36只，8周齡，體重190g～220g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，隨機(jī)分為6組：安靜對照組、運(yùn)動0.5小時組、運(yùn)動1小時組、運(yùn)動1小時后1小時組、運(yùn)動1小時后2小時組、運(yùn)動1小時后6小時組，每組6只。

動物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京體育大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物福利倫理審查委員會同意，并嚴(yán)格按照北京體育大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)室規(guī)定執(zhí)行。屏障環(huán)境飼養(yǎng)，溫度23±2℃，相對濕度65±5%，晝夜交替時間為12/12小時。每籠4只，自由飲食與飲水。

1.2 運(yùn)動形式

大鼠購進(jìn)后安靜飼養(yǎng)3天，以適應(yīng)新環(huán)境，然后跑臺運(yùn)動適應(yīng) 3天（第 1天 10m/min×10min，第 2天 10m/min×15min，第 3 天 15m/min×15min），休息 1 天，分別進(jìn)行0.5小時、1小時大強(qiáng)度運(yùn)動（25m/min，5%坡度，相當(dāng)于75%VO2max）［4，5］。

1.3 取材

各組大鼠按規(guī)定時間點(diǎn)稱重，用2%戊巴比妥鈉0.25ml/100g）腹腔注射麻醉［6］，腹主動脈取血后，迅速分離大鼠右后肢肌肉，取等量的紅、白腓腸肌，用錫紙包好，投入液氮中保存。取材完畢后將標(biāo)本轉(zhuǎn)移至－80℃冰箱保存，備用。

1.4 指標(biāo)測試

1.4.1 骨骼肌 3-MH 含量檢測［7，8］

腓腸肌的處理：稱取約50mg肌組織，加入含500μl高氯酸（3.0%）的離心管內(nèi)，高速勻漿，然后4℃下14000g離心25min，提取上清液，用于高效液相技術(shù)檢測3-MH含量。

柱前衍生：取50μl上清液至離心管內(nèi)，加入0.2mM硼酸鈉125μl，旋渦振蕩，緩慢加入乙睛（含熒光胺1.6g/L）125μl，混勻，靜置 5min，加入 70%高氯酸 18μl，蓋緊離心管，80℃水浴1小時。冷卻至室溫，加入3M NaOH含 0.5M MOPS）50μl，使標(biāo)本液 pH在 6.0左右，即上機(jī)分離、檢測。

色譜條件：流動相采用10mM磷酸鈉緩沖液（含30%乙腈，pH7.5），等度洗脫，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量25μl，經(jīng) Zorbarx SB-C18 柱（4.6×150mm，5μm，柱溫為常溫）分離，熒光分光光度計檢測，激發(fā)365nm，發(fā)射460nm。

色譜分離：3-MH的出峰時間約為5.9分鐘。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制3-MH標(biāo)準(zhǔn)液（Sigma公司）的濃度分別為 2.5、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0μmol/ml，按樣品處理方法進(jìn)行測定。利用3-MH標(biāo)準(zhǔn)品的不同濃度（C，μmol/ml）與各自對應(yīng)的面積（S）建立回歸方程。

1.4.2 26S蛋白酶體活性測試

參考 Ventrucci G［9］和 Combaret L［10］的方法，并做改動。

胞漿蛋白提?。喝‰枘c肌約100mg，加入0.5ml勻漿緩沖液［50mM Tris-HCl（pH7.5）、10mM ATP、10mM Mg-Cl2、1mM DTT、20μM PMSF、250mM sucrose、10%glycrol、proteases inhibitors cocktail（1pellet/50ml）］，高 速 勻漿，然后4℃下15000g離心15分鐘，取上清，檢測組織蛋白濃度和酶活性。

分析緩沖液配制：50mM Tris（pH7.5），5mM MgCl2，1mM DTT。

26S蛋白酶體活性檢測：在黑色專用96孔熒光檢測板加入各種試劑（見表1）。用POLARstar Galaxy Microplate Reader（BMG公司）儀器進(jìn)行檢測：激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長460nm，溫度設(shè)為37℃，每 5分鐘讀一次，連續(xù)檢測1小時，所測讀數(shù)以每個樣品蛋白含量糾正。

表1 26S蛋白酶體活性檢測反應(yīng)體系

1.4.3 26S蛋白酶體C2亞基mRNA表達(dá)

用Trizol（invitrogen公司）提取骨骼肌總 RNA，其中加入RNase inhibitor抑制RNA降解，DNaseⅠ消除基因組 DNA，以保證 RNA純度。取 1μl總 RNA，經(jīng) ND-100 Spectrophotometer（Nano Drop公司）紫外分光光度計測定RNA純度和濃度。

采用TOYOBO公司的試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)體系為 5×RT buffer 4μl，dNTP （10mM）2μl，Oligo（dT）1μl，Reverse Tra Ace 1μl，RNase inhibitor 1μl，1μg 總RNA，加 DEPC-treated water至 20μl。反應(yīng)程序?yàn)?42℃ 30min，85℃ 5min，4℃ 5min，-20℃保存待用。

由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成引物，上游引物 5’-AAA GCA AGG CTC AGC GAC AG-3’，下游引物 5’-GGC GAG ATA CGG GAA GTG GT-3’（GenBank M29859），長度 236bp。

采用TOYOBO公司提供的SYBR Green Realtime PCR MasterMix試劑盒在TQTM5實(shí)時熒光定量儀（Bio-Rad公司）進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為 cDNA 0.5μl、上下游引物各為 0.5μl、ddH2O 8.5μl、SYBR Green Mix 10μl，總體積為 20μl。反應(yīng)程序?yàn)?4℃ 240s，（94℃ 20s，62℃ 20s，72℃ 10s） 重復(fù) 45 次。以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參，每份樣品重復(fù)三次，采用相對 CT值定量分析（2-△△CT）。公式如下：△△CT=△CT處理樣品－△CT未處理樣品，其中，△CT=CT測試指標(biāo)－CT內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS 13.0分析處理，進(jìn)行單因素方差（One-Way ANOVA）分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，方差齊時用LSD方法，方差不齊時用Tamhane’s方法，P<0.05為顯著性差異，P<0.01為非常顯著性差異。

2 結(jié)果

測試結(jié)果（表2）顯示：（1）運(yùn)動后即刻腓腸肌3-MH含量增加（P<0.01），其中運(yùn)動0.5小時值最高，為安靜水平的3倍（P<0.01），運(yùn)動后逐漸恢復(fù)至安靜水平，但運(yùn)動后6小時又升高，達(dá)到安靜時的2.3倍（P<0.01）。（2）運(yùn)動0.5小時即刻，26S蛋白酶體活性升高，是安靜時的1.3倍（P<0.05），運(yùn)動1小時即刻和恢復(fù)期活性下降至約安靜水平，運(yùn)動后6小時活性又升高至安靜時的1.3倍（P<0.05）。（3）26S蛋白酶體的C2亞基mRNA在運(yùn)動即刻以及運(yùn)動后1、2小時表達(dá)都低于安靜時，并在運(yùn)動1小時即刻具有顯著性（P<0.05），運(yùn)動后6小時表達(dá)突然升高到安靜時的2.3倍（P<0.01）。

表2 大強(qiáng)度運(yùn)動前后大鼠腓腸肌3-MH含量、26S蛋白酶體活性及C2亞基mRNA表達(dá)變化

3 討論

3-甲基組氨酸（3-MH）存在于骨骼肌、心肌的肌動蛋白（actin）和肌凝蛋白（myosin）中［11］，是組氨酸形成組氨酰tRNA后發(fā)生甲基化的產(chǎn)物。3-MH一旦從多肽上降解下來便不能作為tRNA的底物合成新肽鏈，也不會再被分解［12］。檢測3-MH含量可以間接反映肌纖維收縮蛋白的降解。大部分人體和動物實(shí)驗(yàn)采用尿3-MH含量進(jìn)行評價，但尿3-MH含量部分還來源于機(jī)體其它器官，而測量肌肉3-MH含量可以真實(shí)反映骨骼肌收縮蛋白降解的變化。本研究檢測了運(yùn)動后骨骼肌3-MH含量變化，這樣的研究還未見報道。我們采用的25m/min跑臺速度、5%坡度運(yùn)動對于大鼠來說相當(dāng)于75%VO2max的運(yùn)動強(qiáng)度，運(yùn)動 1小時后，接近疲勞，與 Hollander等［5］的動物實(shí)驗(yàn)一致。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，運(yùn)動后即刻腓腸肌3-MH含量較安靜時顯著升高，其中運(yùn)動0.5小時后即刻3-MH含量比運(yùn)動1小時多，運(yùn)動后6小時又非常顯著高于安靜水平，提示運(yùn)動中肌肉收縮蛋白降解增加，隨著運(yùn)動時間延長，降解增加的程度減少，在運(yùn)動后短時間內(nèi)降至安靜水平，但運(yùn)動后6小時收縮蛋白降解又增加，這可能與肌纖維結(jié)構(gòu)改變、運(yùn)動能力降低有聯(lián)系，但很遺憾我們沒有觀察超微結(jié)構(gòu)變化。

有研究表明，肌肉蛋白質(zhì)降解可以通過四種途徑來完成，即溶酶體途徑、calpain途徑、caspase途徑和泛素蛋白酶體途徑［13］。泛素蛋白酶體途徑被認(rèn)為負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)80～90%的蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，包括 actin 和 myosin［14］，在肌纖維蛋白降解中具有重要作用。泛素蛋白酶體途徑由多種組分構(gòu)成，即泛素、負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)泛素化的酶（泛素活化酶、泛素結(jié)合酶、泛素連接酶、E4、去泛素化酶）以及26S蛋白酶體。首先，負(fù)責(zé)泛素化的酶將多個泛素分子與底物蛋白結(jié)合，從而標(biāo)記底物蛋白，然后被26S蛋白酶體識別和降解，途徑中任一組分上調(diào)都會加強(qiáng)蛋白質(zhì)的降解。負(fù)責(zé)降解蛋白質(zhì)的26S蛋白酶體是一個巨大的胞漿蛋白酶復(fù)合物，含多個亞基，由20S蛋白酶體和多種調(diào)節(jié)復(fù)合物（如19S調(diào)節(jié)復(fù)合體）組成，具有多種蛋白酶活性，如類糜蛋白酶活性、類胰蛋白酶活性、谷氨酰水解酶活性、支鏈氨基酸肽酶活性和中性氨基酸切割活性等，其中類糜蛋白酶位點(diǎn)對多肽的切割是降解26S蛋白酶體降解蛋白質(zhì)的限速步驟［15］。本研究利用能產(chǎn)生熒光的肽底物——Suc-LLVY-AMC分析腓腸肌26S蛋白酶體類糜蛋白酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)運(yùn)動0.5小時活性升高，隨后降低，運(yùn)動后6小時又升高，與肌肉3-MH含量變化近一致，提示運(yùn)動引起的26S蛋白酶體活性的升高可能加強(qiáng)了收縮蛋白的降解。在治療肌萎縮或因疾病引起的肌消耗癥時，常用抑制蛋白酶體活性的藥物［16］，但不清楚它是否能減緩大強(qiáng)度引起的蛋白大量降解。不過，國外學(xué)者Kee等［17］發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過5天訓(xùn)練的大鼠與不訓(xùn)練大鼠都進(jìn)行一次急性跑臺運(yùn)動后，前者蛋白酶體活性比后者低，認(rèn)為運(yùn)動適應(yīng)可減小肌肉泛素蛋白酶體途徑對運(yùn)動應(yīng)激的反應(yīng)，有利于蛋白質(zhì)合成。

有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)26S蛋白酶體C2亞基mRNA表達(dá)不完全和其活性變化一致，在運(yùn)動后即刻和短時間子恢復(fù)期內(nèi)mRNA含量較安靜水平減少，而運(yùn)動后6小時非常顯著增加至安靜時2.3倍。其實(shí)，26S蛋白酶體活性不僅受亞基含量影響，還受亞基組裝與激活的控制，其基因調(diào)控比途徑其它組分基因更受嚴(yán)密［18］。在劇烈運(yùn)動初期，26S蛋白酶體活性提高，一方面可以加快降解錯誤折疊、氧化損傷等蛋白，以保證細(xì)胞正常代謝；另一方面加快一些調(diào)節(jié)蛋白的降解，改變信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞功能以適應(yīng)運(yùn)動應(yīng)激。但是，過度增強(qiáng)的活性可能會對細(xì)胞造成傷害［19］，因此，運(yùn)動后短時間內(nèi) C2亞基基因表達(dá)的降低，可能是調(diào)控26S蛋白酶體活性的一種方式，以免活性過度升高。所以我們發(fā)現(xiàn)由于亞基基因表達(dá)持續(xù)低下，使得26S蛋白酶體活性在運(yùn)動0.5小時升高后開始降低，一直到運(yùn)動后6小時C2基因表達(dá)才又明顯升高，而此時的蛋白酶體活性也明顯增強(qiáng)。這可能是由于細(xì)胞外因素變化，如糖皮質(zhì)激素、TNF-α、IL-1、IL-6等激活細(xì)胞內(nèi)某些信號通路［20-22］，提高了基因的表達(dá)，加強(qiáng)了蛋白酶體組裝，使蛋白酶體活性增強(qiáng)。運(yùn)動后蛋白酶體活性的升高，可以加強(qiáng)氨基酸周轉(zhuǎn)，為物質(zhì)的合成提供能量（禁食的時候）以及為促進(jìn)運(yùn)動后蛋白質(zhì)的重塑提供基礎(chǔ)［23，24］。

4 總結(jié)

大強(qiáng)度運(yùn)動后即刻和運(yùn)動后6小時大鼠腓腸肌收縮蛋白降解增加，可能是26S蛋白酶體活性升高所致，其中26S蛋白酶體C2亞基mRNA表達(dá)調(diào)控著運(yùn)動對其活性的影響。

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