醒腦靜注射液對內(nèi)毒素休克家兔血漿細胞因子含量的影響

余文靜 林燕 李著華△

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室;2.瀘州醫(yī)學(xué)院機能實驗室,四川 瀘州 646000)

內(nèi)毒素又稱脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜上的一種含有多糖和類脂的特殊物質(zhì)。內(nèi)毒素休克(Endotoxin Shock),是由革蘭氏陰性菌內(nèi)毒素引起的以發(fā)熱、低血壓及多器官功能衰竭為主要特征的綜合征,死亡率高,是臨床常見的危急重癥之一,目前尚無令人滿意的治療藥物。有研究證實[1-4],醒腦靜注射液能通過抑制腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達,有效地抑制炎性級聯(lián)反應(yīng),減輕內(nèi)皮細胞損傷,清除氧自由基。本實驗擬通過觀察內(nèi)毒素休克模型家兔血清中促炎因子TNF-α及抗炎因子白細胞介素-10(IL-10)含量的變化,探討醒腦靜注射液抗內(nèi)毒素休克的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康日本大耳白兔18只(合格證號：20054020),體重2-2.5kg,雄性,清潔級動物,由瀘州醫(yī)學(xué)院實驗動物科提供。

1.2 試劑 醒腦靜注射液購自河南天地藥業(yè)股份有限公司;內(nèi)毒素(LPS)購自美國 Sigma公司;兔 TNF-α、IL-10試劑盒,均購自上海西唐生物科技有限公司。

1.3 儀器 BL-420生物機能實驗系統(tǒng)。

1.4 動物實驗 日本大耳白兔18只,隨機分為正常組6只,LPS組6只,LPS+XNJ組6只。耳緣靜脈注射1%戊巴比妥鈉全麻,分離右頸總動脈,插管,BL-420生理儀觀察并記錄平均動脈壓、心率變化。分離右側(cè)股動脈插管放血。待 10-20min平均動脈壓穩(wěn)定后記錄平均動脈壓、心率并定為記錄0點。LPS組和 LPS+XNJ組沿耳緣靜脈推注 LPS2.4mg?kg-1,正常組推注等量生理鹽水。待血壓下降至正常的 2/3后,治療組沿耳緣靜脈推注醒腦靜注射液0.5ml?kg-1,正常組和模型組推注等量生理鹽水。以上各組分別于推注后0、1、2、3h取血2ml,同時回輸?shù)攘可睇}水。所取血以3000r?min-1離心10min,取血漿測 TNF-α及IL-10的含量。

1-5 觀察并計算動物的存活率

1-6 細胞因子(TNF-α以及IL-10)測定 按試劑盒說明操作,設(shè)空白管、標準管和測定管,各管一式兩份。450nm讀取吸光值,繪制標準曲線,在標準曲線上讀取各待測標本含量。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS16.0 for windows軟件包分析處理。計量資料用均數(shù)±標準差()表示,用 t檢驗,p＜0.05為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 平均動脈壓及心率的變化 LPS組與PLS+XNJ組在靜脈注入內(nèi)毒素后60min動脈血壓即下降至正常的2/3,PLS組在0h開始平均動脈壓進行性下降;PLS+XNJ組在0h開始平均動脈壓平緩下降,具體數(shù)值如表1示。LPS組0h心率明顯加快,在1h達到頂峰,2h迅速下降,3h降至最低,直至死亡;LPS+XNJ組0h心率明顯加快,1h達到頂峰,2h開始減慢,減慢幅度較LPS組小。

2.2 存活率 正常組動物全部存活,存活率為100%。注射LPS后3h,LPS組動物全部死亡,存活率為0。注射LPS后3h,LPS+XNJ組動物全部存活,存活率為100%。

2.3 血漿 TNF-α檢測 正常組兔血漿 TNF-α濃度在 4個時間點無變化(p＞0.05)。LPS組血漿TNF-α濃度在4個時間點表現(xiàn)趨勢為逐漸增高,與0時間點比較差異均有顯著性(p＜0.01)。LPS+XNJ組血漿TNF-α濃度在 0時間點為峰值,在1h、2h、3h逐漸下降,與 0時間點比較差異均有顯著性(p＜0.05,p＜0.01)。在 0h、1h、2h、3h 時間點正常組、LPS組、LPS+XNJ組比較,差異均有顯著性(p＜0.05,p＜0.01)。具體數(shù)值如表2示。

2.4 血漿IL-10檢測 正常組兔血漿IL-10濃度在4個時間點無變化(p＞0.05)。LPS組血漿IL-10濃度在 4個時間點表現(xiàn)趨勢為逐漸增高,與0時間點比較差異均有顯著性(p＜0.05,p＜0.05)。LPS+XNJ組血漿 IL-10濃度在2時間點為峰值,3h時明顯下降,與組內(nèi)0時間點比較差異有顯著性(p＜0.01),與同一時間點 LPS組比較,差異均有顯著性(p＜0.01)。具體數(shù)值如表3示。

3 討論

內(nèi)毒素進入機體后以游離的形式釋放或以內(nèi)毒素-菌體蛋白復(fù)合體的形式釋放。在血液循環(huán)中的內(nèi)毒素可刺激機體產(chǎn)生一系列的生物活性介質(zhì),從而介導(dǎo)了眾多病理生理學(xué)效應(yīng)。近年研究認為,促炎和抗炎性介質(zhì)共同失控性釋放是引起內(nèi)毒素休克的主要原因[5],它導(dǎo)致了免疫反應(yīng)性失常,改變了免疫細胞的免疫性,引起內(nèi)皮細胞的損傷和全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic Inflammatory Response Syndrome,SIRS),炎癥介質(zhì)在其發(fā)病機制中起重要作用。

腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)是內(nèi)毒素進入人體內(nèi)誘導(dǎo)機體效應(yīng)細胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)最早出現(xiàn)的一種炎癥介質(zhì),被認為起到關(guān)鍵作用。實驗證明[6],內(nèi)毒素損傷存在著TNF-α等血清促炎細胞因子水平的升高,單核細胞或外周血單核細胞及巨噬細胞核轉(zhuǎn)錄因子-κ B(Nuclear transcription factor-kappa B,NF-κ B)活性的增強,進而啟動包括IL-8等其它細胞因子和粘附分子的炎癥分子的表達。TNF-α生成后,又可刺激單核巨嗜細胞生成一系列介質(zhì)而形成瀑布效應(yīng),造成機體死亡。

表1 促炎因子TNF-α濃度的變化±s,n=6)

表1 促炎因子TNF-α濃度的變化±s,n=6)

注：LPS組與正常組同時間點比較△P＜0.05,△△P＜0.01;LPS+XNJ組與LPS組同時間點比較▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;與組內(nèi)0h時間點比較＊P＜0.05,＊＊P＜0.01;與組內(nèi)前一時間點比較#P＜0.05,##P＜0.01。

組別/時間 正常組 LPS組 LPS+XNJ組0h 16.82±1.29 99.81±6.89△△ 103.99±5.451h 18.90±0.28 111.51±1.61△△ 98.40±1.99▲＊2h 24.22±0.97 129.94±2.83△△ 42.86±3.0▲▲＊＊##3h 26.88±0.53 139.81±0.38△△ 31.53±2.45▲▲＊＊

表2 抗炎因子IL-10濃度的變化(±s,n=6)

表2 抗炎因子IL-10濃度的變化(±s,n=6)

注：LPS組與正常組同時間點比較△P＜0.05,△△P＜0.01;LPS+XNJ組與LPS組同時間點比較▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;與組內(nèi)0h時間點比較＊P＜0.05,＊＊P＜0.01;與組內(nèi)前一時間點比較#P＜0.05,##P＜0.01。

組別/時間 正常組 LPS組 LPS+XNJ組0h 25.53±1.37 35.84±3.45 38.60±2.081h 29.64±1.37 54.67±4.22△ 109.62±2.972h 34.46±0.69 178.87±7.96△△ 814.73±27.47▲▲＊＊##3h 37.22±0.69 322.16±16.34△△ 116.41±12.72▲▲＊＊##

IL-10是目前公認的炎癥和免疫抑制細胞因子,主要由Th2細胞產(chǎn)生,具有良好的抗炎和免疫抑制特性。它一方面能抑制炎性因子的合成與釋放,包括 TNF-α、IL-1、IFN-γ等眾多前炎性細胞因子;另一方面能直接抑制炎性細胞的激活、遷移與粘附,并與其它抗炎介質(zhì)有協(xié)同作用。Tokuda M[7]發(fā)現(xiàn)IL-10通過抑制NF-Κ B的活化來抑制腎小管細胞中IL-6和IL-8 mRNA的表達;Olivier[8]發(fā)現(xiàn)IL-10可以通過抑制I-Κ B激酶α/β復(fù)合體來抑制 NF-Κ B的活性。以上研究顯示,IL-10是一種炎癥反應(yīng)的負調(diào)節(jié)因子,可廣泛抑制炎癥介質(zhì),有利于重建體內(nèi)炎癥介質(zhì)及抗炎介質(zhì)的平衡。

從本實驗結(jié)果中可以看出,在內(nèi)毒素休克一開始TNF-α即開始升高,用藥后2h開始明顯下降,說明醒腦靜注射液通過抑制TNF-α,從而有效地抑制炎癥反應(yīng)引發(fā)的級聯(lián)反應(yīng),;而IL-10在內(nèi)毒素休克一開始升高緩慢,用藥后2h達到頂峰,說明醒腦靜注射液能促進內(nèi)毒素休克時IL-10的表達來對抗 TNF-α的損害作用,通過調(diào)節(jié) TNF-α/IL-10這一對促炎和抗炎因子的平衡來抑制內(nèi)毒素引起的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。

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2 Wang WJ,Zhong M,Guo Y,et a1.Effects of musk glucoproteinon chemo taxis of polymorphonuclear leukocytes in vivo and invitro[J].J Chin Mater Medica,2003,28(1)：59-60.

3 Zhu J,Xie WE,Jin YZ,et a1.Effect of gardenia jasminoides ellis on sertlm IL-l and T NF-αof rheumatoid arthritis rats[J].Chinese T raditional Patent Medicine,2005,27(7)：801-809.

4 Zhang XY,Zhang ZJ,Wang Z,et a1.Effect of gardenin on gene expression profile in brain of rats with focal cerebral ischemia[J].Chinese Journal of Integrated T raditional and Western Medicine,2005,25(1)：42-44.

5 楊友竹,譯.SIRS與CA RS的病理狀態(tài)和診斷標準[M].日本醫(yī)學(xué)介紹,2001,22(9)：408-409.

6 梁敏,白令君.丹參創(chuàng)傷性急性肺損傷治療作用的實驗研究[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué),2000,12(9)：515-517.

7 Tokuda M,Nagaoka S,et al.Interleukin-10 inhibits expression of interleukin-6 and-8 mRNA in human dental pulp cell cultures via nuclear factor-kappa B deactivation[J].J Endod,2002,28(3)：177-180.

8 Olivier Tabary,Ce1ine,Muselet,et al.Interleukin-10 inhibits elevated chemokine interleukin-8 and regulated on activation normal T cell expressed and secreted production in cystic fibrosis bronchial epithelial cells by targeting the Iκ B kinase α/β complex[J].Am J Pathol,2003,162(1)：293-302.