康寧木霉誘變菌株產(chǎn)酶條件的研究

刁彩霞，甘文平，麻名漢

（黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院畜牧特產(chǎn)所，哈爾濱 150038）

纖維素是地球上數(shù)量最大的可再生資源，微生物對(duì)其降解、轉(zhuǎn)化是自然界中碳元素轉(zhuǎn)化的主要環(huán)節(jié)。纖維素的生物轉(zhuǎn)化與利用對(duì)解決當(dāng)前世界能源危機(jī)、糧食短缺和環(huán)境污染等問題具有重要意義。近年來，我國對(duì)纖維分解菌的應(yīng)用研究十分活躍，已篩選出具有獨(dú)特的纖維素分解作用的高產(chǎn)菌株，其在長期保存新鮮秸稈營養(yǎng)成分的同時(shí)，可降低纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的含量，不僅適口性好，保存期長，而且操作簡便，成本低，為糧食主產(chǎn)區(qū)發(fā)展畜牧業(yè)提供了廣闊的飼料資源[1-9]。

為此，本研究小組開展了混合菌株在東北地區(qū)主要農(nóng)作物玉米秸稈和稻草上的應(yīng)用研究，本文主要對(duì)2株產(chǎn)纖維素酶較高的黑曲霉菌株和康寧木霉菌株進(jìn)行了產(chǎn)酶效果的比較研究，并進(jìn)一步摸索了培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試劑：水楊素、羧甲基纖維素鈉；試驗(yàn)中所用其他試劑均為分析純。

菌種及培養(yǎng)基：黑曲霉（Aspergillitus niger）jg1、康寧木霉（Trichoderma koningii）jg2由本研究室保藏。

斜面培養(yǎng)基：黑曲霉jg1采用PDA培養(yǎng)基，康寧木霉jg2采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基。

三角瓶培養(yǎng)基：黑曲霉：稻草粉 50 g·L－1、麥麩 10 g·L－1、（NH4）2SO410 g·L－1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L－1?？凳夏久古囵B(yǎng)基中含稻草粉 50 g·L－1、麥麩10 g·L－1、牛肉蛋白胨 5 g·L－1、起始 pH 5.0。

誘變初篩培養(yǎng)基：CMC-Na 2 g·L－1，牛肉蛋白胨 5 g·L－1，瓊脂 14 g·L－1，剛果紅 0.2 g·L－1，脫氧膽酸鈉 10 g·L－1，pH 5.0。

1.2 試驗(yàn)方法

將黑曲霉和康寧木霉菌種接種于斜面培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4～6 d后使用或在4℃下保存，250 mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，121℃滅菌20 min，接種用生理鹽水沖洗的孢子1mL（孢子數(shù)107個(gè)·mL－1），28 ℃ 在 120 rpm 搖床上振蕩培養(yǎng)168 h，離心上清液即為粗纖維素酶液。

pH用酸度計(jì)測定。纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的測定參考王建兵的方法[10]。殘余還原糖的測定采用DNS法。

酶活力的測定采用CMC酶活性測定方法，取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，加入1%的CMC溶液（溶于 pH 4.8 的 0.1mol·L－1HAc-NaAc緩沖液中）1mL，50℃ 保溫 30 min，加入 DNS試劑3 mL，沸水浴5min，冷卻后加水稀釋到25mL，在520 nm處測還原糖。濾紙酶活力的測定：取適當(dāng)稀釋的酶液0.5 mL，加入緩沖液（pH 4.8 的 0.1 mol·L－1HAc-NaAc）1mL中，并加入1條1×6 cm的濾紙，500℃保溫1 h，加入DNS試劑3mL，沸水浴5min，冷卻后加水稀釋到25mL，在520 nm處測還原糖。β-葡萄糖苷酶活力測定：取適當(dāng)稀釋的酶液0.5mL，加入1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%的水楊素溶液（溶于pH 4.8的0.1mo1·L－1HAc-NaAc緩沖液中）。50 ℃ 保溫30min，再加入DNS試劑3mL，沸水浴5min，冷卻后加水稀釋到 25 mL，在 520 nm處測還原糖。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試菌種產(chǎn)纖維素酶能力的比較

以秸稈為主要碳源，對(duì)受試菌種三角瓶產(chǎn)纖維素酶的水平進(jìn)行了反復(fù)比較，結(jié)果見表1。

表1 受試菌種產(chǎn)酶能力的比較

由表1可見，康寧木霉jg2產(chǎn)酶較高，殘余還原糖較少，故選用康寧木霉jg2進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2 康寧木霉jg2誘變前后產(chǎn)酶能力的比較

為了提高康寧木霉產(chǎn)纖維素酶的能力，對(duì)其進(jìn)行了紫外線和硫酸二乙酯（DES）復(fù)合誘變，經(jīng)初篩、復(fù)篩獲得了誘變菌株jg4，其產(chǎn)酶能力情況見表2。

由表2可見，經(jīng)誘變后各組分均有一定程度的提高，由硫酸二乙酯誘變后的菌種為康寧木霉jg4，在麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上傳代5次，每代進(jìn)行發(fā)酵酶活力測定，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶能力沒有大的變化，說明其遺傳穩(wěn)定性較好，故以此菌種進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表2 康寧木霉jg2經(jīng)誘變后產(chǎn)酶能力的變化

2.3 不同碳源對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響

分別以稻草粉、秸稈粉、麥麩（均過80目篩）取代發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源，研究了碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見表3。

由表3可見，康寧木霉jg4以稻草為碳源的酶活力最高，其次是秸稈，麥麩最低。

表3 不同碳源對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響

2.4 不同氮源對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響

選取常用的氮源：豆餅、蛋白胨、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、尿素為研究因素，比較不同氮源對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響，結(jié)果見表4。

由表4可見，無機(jī)氮對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響優(yōu)于有機(jī)氮，氨態(tài)氮優(yōu)于硝態(tài)氮，（NH）4SO4為氮源時(shí) CMCCase、濾紙酶、β-葡萄糖苷酶活力皆最高，殘余還原糖量也處于較低的水平，這一結(jié)果與李愛華等的試驗(yàn)結(jié)果一致[11]。因此，本研究選用（NH）4SO4作為氮源。

表4 不同氮源對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響

2.5 通氣量對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響

250 mL三角瓶裝填不同體積的培養(yǎng)基，進(jìn)行產(chǎn)酶試驗(yàn)，結(jié)果見表5。

由表5可見，250mL三角瓶裝30～60 mL培養(yǎng)基均能獲得較佳的產(chǎn)酶效果，但隨著裝液量的繼續(xù)增加，產(chǎn)酶水平逐漸下降，這可能是由于供氧不足，不利于康寧木霉的生長。本試驗(yàn)選擇了40mL培養(yǎng)基。

表5 通氣量對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響

2.6 培養(yǎng)溫度對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶也有很大的影響，本研究選擇了不同溫度進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見表6。

從表6可見，30℃產(chǎn)酶水平最高，較低溫度對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶不利，可能是因?yàn)檩^低溫度會(huì)影響菌絲體的生長。

表6 培養(yǎng)溫度對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響

2.7 接種量對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響

試驗(yàn)用孢子懸浮液，孢子為麥芽汁瓊脂斜面培養(yǎng)4～6 d后，用生理鹽水充分沖洗得到，用不同體積的孢子懸浮液接種見表7。

由表7可見，接種量對(duì)產(chǎn)酶影響不大，本研究選擇接種2mL抱子懸浮液、30mL發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.8 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草2.4 g，麥麩1.2 g，（NH4）2SO41%，裝液量40mL，轉(zhuǎn)速140 rpm，培養(yǎng)溫度30℃，每 12 h取 1次樣，研究殘余還原糖及纖維素酶活力的變化，結(jié)果見圖1、2。

從圖1可見，在發(fā)酵過程中，由于菌體生長消耗，殘余還原糖先下降，隨后上升，說明康寧木霉產(chǎn)生了水解酶，將麥麩和稻草粉降解為還原糖，但隨著發(fā)酵的進(jìn)行，還原糖會(huì)逐漸被菌體消耗而下降。

表7 接種量對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶的影響

圖1 搖瓶發(fā)酵過程中殘余還原糖變化

圖2 搖瓶發(fā)酵過程中FPA, β-葡萄糖苷酶，CMC酶活力的變化

從圖2可見，康寧木霉jg4發(fā)酵過程中CMC酶活曲線有兩個(gè)峰值，36 h時(shí)CMC酶活力出現(xiàn)第1個(gè)高峰，酶活力達(dá)80.45 U·mL－1，隨后緩慢下降，其最高峰值出現(xiàn)在132 h，隨后緩慢下降；濾紙酶活力和β－葡萄糖苷酶活力也在132 h出現(xiàn)峰值。

3 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件對(duì)康寧木霉jg4產(chǎn)酶均有顯著影響，當(dāng)以稻草粉和秸稈為主要碳源時(shí)，有利于康寧木霉jg4發(fā)酵產(chǎn)酶，這表明其產(chǎn)酶為誘導(dǎo)酶，在試驗(yàn)中氮源選用硫酸銨較好，說明康寧木霉jg4利用無機(jī)氮的能力較強(qiáng)。試驗(yàn)表明，康寧木霉jg4液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為：稻草粉 50 g·L－1，麥麩 10 g·L－1，硫酸銨 10 g·L－1，裝液量40mL，pH自然。發(fā)酵條件為：培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)數(shù)120 rpm，培養(yǎng)時(shí)間為132 h。

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