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    麻雞脾臟總RNA提取方法初探

    2010-05-01 05:14:40陳書明常云花梁新峰曹新鵬
    山西農(nóng)業(yè)科學(xué) 2010年10期

    陳書明,常云花,梁新峰,曹新鵬,范 瑾

    (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山西太谷030801)

    白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)簡稱白介素,是由白細(xì)胞產(chǎn)生并介導(dǎo)于細(xì)胞間相互作用的一類細(xì)胞因子。其主要作用是通過T和B淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞等多種靶細(xì)胞來傳遞免疫信息,以激活、調(diào)控血細(xì)胞的生長發(fā)育與分化成熟,并參與機(jī)體的免疫應(yīng)答以及某些疾病的病理過程[1-3]。目前,IL已作為藥物應(yīng)用于臨床,但用傳統(tǒng)的從組織中分離純化IL,很難實現(xiàn)IL的大量生產(chǎn)。因此,通過RT-PCR技術(shù)獲得IL的目的基因,再用基因工程技術(shù)規(guī)?;a(chǎn)IL成為科研工作者努力的方向。而獲得IL的目的基因需要先從脾臟組織提取出純度高、完整性好的總RNA。目前,已有多種方法與產(chǎn)品應(yīng)用于總RNA提取和純化,但在實驗過程中,總RNA極易被實驗室環(huán)境中存在的RNA酶降解,或提取出來的總RNA中常伴有大分子量染色體DNA的污染[4-7]。

    本研究通過控制RNAiso Plus試劑和脾臟組織用量比例,對組織和實驗室環(huán)境進(jìn)行特殊處理,反復(fù)研究,最終從麻雞脾臟組織中提取出純度高、完整性好的總RNA。該研究對分子克隆獲得相關(guān)目的基因等后續(xù)實驗具有重要意義。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    1.1.1 試驗動物 自山西省太谷縣某雞場購進(jìn)80日齡健康麻雞1只。

    1.1.2 試驗試劑 Agarose(瓊脂糖)為Amresco原裝進(jìn)口;RNAiso Plus購自大連寶生物工程有限公司;Tris和DEPC均購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;EDTA、硼酸、95%乙醇、異丙醇、氯仿、溴化乙錠均為國產(chǎn)分析純。75%乙醇、溴化乙錠等用RNase-free ddH2O配制。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 樣品的制備 在潔凈環(huán)境下將麻雞殺死,迅速取出其脾臟,用刀片切成約140,120,80mg的小塊組織,用滅菌紗布包裹后懸吊于液氮罐中保存?zhèn)溆谩L崛NA時,從液氮罐中取約140,120,80mg小塊組織各1塊,迅速轉(zhuǎn)移至3個液氮預(yù)冷的研缽中研磨,其間不斷加入液氮,直至研磨成粉末狀(無明顯的可見顆粒,否則會影響RNA的收率和質(zhì)量);再向3個研缽中各加1mL RNAiso Plus,將研磨成粉末狀的樣品完全覆蓋,然后室溫下靜置,待其溶化;然后將各組勻漿液轉(zhuǎn)移至已標(biāo)記的EP管中,室溫靜置5min。

    1.2.2 制備RNA沉淀 將EP管中的勻漿液在4℃,12 000 r/min條件下離心5min;小心吸取上清液,分別移入已滅菌標(biāo)記的EP管中(切勿吸取沉淀);再向EP管中分別加入0.2mL氯仿,蓋緊管蓋,用旋渦振蕩儀混勻至溶液呈乳白狀(無分層現(xiàn)象),室溫靜置 5min;4℃,12 000 r/min離心15min。此時,EP管中液體分為3層,即含有RNA的無色上清液,中間的白色蛋白層和帶有紅色的下層有機(jī)相。小心吸取上清液并分別轉(zhuǎn)移至新標(biāo)記的3個已滅菌的EP管中(切勿吸取白色中間層),再分別加入等體積的異丙醇,上下顛倒EP管充分混勻,室溫下靜置10min;然后于4℃,12 000 r/min離心10min,可見EP管底部出現(xiàn)乳膠狀沉淀,小心棄去上清液,保留沉淀,即為RNA沉淀。

    1.2.3 RNA沉淀的洗滌 沿保留RNA沉淀的EP管的管壁緩緩加入75%的乙醇1mL,輕輕上下顛倒EP管5次,在4℃下,12 000 r/min離心5min;然后小心棄凈EP管中的乙醇溶液,再將EP管插入超凈工作臺面的樣品孔中,通風(fēng)干燥5min,使乙醇揮發(fā)干凈(不可以加熱干燥,否則RNA將很難溶解),再用RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀,從而獲得RNA溶液。

    1.2.4 RNA純度與完整性的檢測 取3μL RNA溶液與等量的上樣緩沖液混勻,點樣,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,以檢測所提取RNA的純度與完整性。用紫外分光光度計測定剩余RNA溶液的A260與A280,并計算二者的比值A(chǔ)260/A280,進(jìn)一步分析所提取RNA的純度。

    2 結(jié)果與分析

    對脾臟組織用量約為80 mg時提取的總RNA進(jìn)行紫外分光光度檢測得出,A260=0.896,A280=0.452,A260/A280=1.982。

    從圖1可以看出,當(dāng)組織用量約140mg時,RNA幾乎全部降解(圖1-A);當(dāng)組織用量約120mg時,RNA降解嚴(yán)重(圖1-B);當(dāng)組織用量控制在約80mg左右時,提取到的RNA電泳圖譜中可見清晰的3條帶(圖1-C),分別為5S,18S,28 S,A260/A280=1.982,1.8<A260/A280<2.0,說明從雞脾臟組織中提取的RNA純度與完整性良好。表明用1mL的RNAiso Plus試劑,并且把脾臟組織用量控制在80mg左右時,可提取出純度高、完整性好的總RNA。

    3 討論

    本研究表明,用相同量的提取劑(RNAiso Plus)提取麻雞脾臟組織中的RNA時,并不是組織越多,提取的RNA量就越多;相反,過量的組織中存在過量的RNA酶,所加的RNAiso Plus試劑不能抑制過量RNA酶的活性,使得提取過程中RNA很快被降解。但是,試驗所用脾臟組織也不可太少,否則會因樣品中總RNA含量不足,難以提取出足夠量的純度高、完整性好的總RNA。

    本實驗成功與否的關(guān)鍵是有無RNA酶的污染。RNA極不穩(wěn)定,易被RNA酶降解,而RNA酶幾乎無處不在,且特別穩(wěn)定,故在提取RNA時需最大程度地避免外源RNA酶的污染和抑制內(nèi)源RNA酶的活力。因此,在本實驗中,除了用液氮迅速處理新鮮的麻雞脾臟組織、控制RNAiso Plus試劑和脾臟組織用量比例,以抑制內(nèi)源RNA酶的活力外,還用DEPC溶液對本實驗所用物品進(jìn)行了處理,使用RNA專用儀器設(shè)備,操作過程中使用一次性PE手套和口罩等。上述措施對本實驗的成功起了非常重要的作用。

    [1] 陳紅英,崔保安,黃青云,等.海藍(lán)雞白細(xì)胞介素18全基因的克隆與序列分析 [J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2006,28(1):48-50.

    [2] 胡進(jìn)東,崔志中,范偉興,等.雞白細(xì)胞介素18成熟蛋白全長基因的克隆與序列分析[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2004,24(2):119-121.

    [3] 徐永莉,王紅寧,黃勇,等.雞白介素的分子生物學(xué)和應(yīng)用研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(6):57-60.

    [4] 李晶,王亦學(xué),鄭德剛,等.一種簡單高效提取棉花不同組織總 RNA的方法[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(5):17-19.

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