6種血清的醋酸纖維素薄膜電泳分析

陳書明，曹新鵬，胡 軍，常云花

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801）

醋酸纖維素薄膜電泳是一種以醋酸纖維素薄膜為支持物的電泳方法。由于它具有操作簡單、快捷、價廉、對樣品無吸附等優(yōu)點，目前被廣泛用于血清蛋白、脂蛋白、酶等物質(zhì)的分離分析中。該方法已成為生物與醫(yī)學(xué)研究及臨床檢驗的常規(guī)技術(shù)，也是生物類及醫(yī)學(xué)類專業(yè)學(xué)生必須掌握的一項技術(shù)。然而，因不同動物的血清蛋白組分與含量存在差別，所以不同血清的醋酸纖維素薄膜電泳效果存在很大差異。為了分析這一差異，并提高學(xué)生實驗的效果，一些學(xué)者進(jìn)行了研究。周麗亞等[1]用牛血清代替人血清進(jìn)行醋酸纖維素薄膜電泳，實驗結(jié)果較穩(wěn)定，重復(fù)性較好；蔡杰等[2]用醋酸纖維素薄膜電泳法分離了雞血清；陳巍等[3]采用醋酸纖維素薄膜電泳法分析了寧夏灘羊血清蛋白；劉建強(qiáng)等[4]采用醋酸纖維素薄膜電泳法對青海蟾蜍血清蛋白進(jìn)行了分析。但尚未見相同實驗條件下，用醋酸纖維素薄膜電泳法同時分析健康人和不同動物血清的報道。

本研究采用相同的電泳條件，對人、雞、牛、兔、羊與豬6種血清的蛋白組分進(jìn)行了醋酸纖維素薄膜電泳分析，從而比較不同血清蛋白組分之間的差異。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品 健康人血清由山西省晉中市第二人民醫(yī)院提供；健康雞、牛、兔、羊、豬血清由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧站提供。

1.1.2 材料、試劑與儀器 醋酸纖維素薄膜（2 cm×8 cm）由浙江臺州市路橋四甲生化塑料廠生產(chǎn)；試劑均為國產(chǎn)分析純；DYY-2型電泳儀為北京市六一儀器廠的產(chǎn)品。

1.2 實驗方法

參考劉維全等[5]的方法進(jìn)行。

1.2.1 準(zhǔn)備和點樣 將醋酸纖維素薄膜浸入巴比妥緩沖液中過夜[6]，用鑷子輕輕取出薄膜，放在干凈的濾紙上，輕輕吸去兩面多余的緩沖液。用載玻片（去一角，使寬度為1.6 cm）側(cè)面分別蘸取相同量的人、雞、羊、兔、豬、牛血清，分別垂直印在6張浸泡過的醋酸纖維素薄膜上，點樣線距膜邊緣的距離為2.0 cm；待血清滲入膜內(nèi)后，移去點樣用載玻片；將點好樣的薄膜緊貼在電泳槽中浸透緩沖液的濾紙橋上，點樣端靠近負(fù)極。

1.2.2 電泳 電泳前平衡10min；然后用60 V電壓電泳5min；再調(diào)到95 V電壓，電泳55min。

1.2.3 染色、漂洗、透明與照相 電泳完畢后，立即取出薄膜，浸入染色液中染色6min；然后用漂洗液漂洗，每隔10min換1次漂洗液，連續(xù)換4次；隨后用濾紙吸去薄膜上多余的溶液，用電吹風(fēng)吹干；最后將吹干的薄膜浸入透明液甲中，2min后取出，再浸入透明液乙中，1min后迅速取出薄膜并緊貼于干凈載玻片上，電泳條帶清晰呈現(xiàn)出來，用數(shù)碼相機(jī)拍照。

2 結(jié)果與分析

6 種血清的電泳圖譜如圖1～6所示，各圖中的（+）代表正極，（-）代表負(fù)極。

由圖1可知，雞血清的電泳圖譜為4條帶，從正極到負(fù)極依次為清蛋白和α，β，γ球蛋白。其中，清蛋白含量最高，球蛋白含量高低順序為：γ球蛋白＞β球蛋白＞α球蛋白。

由圖2可知，牛血清的電泳圖譜也是4條帶，從正極到負(fù)極依次為清蛋白和α，β，γ球蛋白。其中，清蛋白含量也是最高，球蛋白含量高低順序為：γ球蛋白＞β球蛋白＞α球蛋白。

由圖3可知，人血清的電泳圖譜為5條帶，從正極到負(fù)極依次為清蛋白和α1，α2，β，γ球蛋白。其中，清蛋白含量最高，α1球蛋白含量最少，α2球蛋白與β球蛋白含量相當(dāng)，γ球蛋白的含量略比α2球蛋白、β球蛋白高。

由圖4可知，兔血清的電泳圖譜也為5條帶，從正極到負(fù)極依次為清蛋白和α1，α2，β，γ球蛋白。其中，清蛋白含量也是最高，α1，α2，β球蛋白含量大致相當(dāng)，γ球蛋白含量略低。

由圖5可見，羊血清的電泳圖譜為4條帶，從正極到負(fù)極依次為清蛋白和α，β，γ球蛋白。其中，清蛋白含量最高，球蛋白含量高低順序為：γ球蛋白＞α球蛋白＞β球蛋白。該結(jié)果與文獻(xiàn)[3]相一致。

由圖6可知，豬血清的電泳圖譜為3條帶，從正極到負(fù)極依次為清蛋白，α與β球蛋白混合帶，γ球蛋白。α球蛋白與β球蛋白混合帶的蛋白含量最高，γ球蛋白的含量與清蛋白的含量相當(dāng)。

綜上所述，在各種血清中，清蛋白的含量都是最高的；其他各種球蛋白的種類與含量隨血清的種類不同而存在差異。而本研究僅是定性分析，各種蛋白組分的定量關(guān)系尚需進(jìn)一步研究。

3 討論

用醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白的主要原理是：血清中的各種蛋白組分分子量不同，以及在同一緩沖體系下所帶凈電荷也存在差異，在同一電場下其泳動速率就不同，從而使血清中的各種蛋白組分得以分離。但要想取得好的實驗結(jié)果，還應(yīng)當(dāng)注意以下幾個方面。

3.1 醋酸纖維素薄膜的選擇與預(yù)處理

薄膜是電泳的支持物，薄膜的質(zhì)量好壞會直接影響到電泳效果。薄膜應(yīng)質(zhì)地均勻、無斑點，可先將挑選好的薄膜的無光澤面用鉛筆標(biāo)號，再浸入電極緩沖液中過夜，使其完全浸透，以達(dá)到平衡狀態(tài)。

3.2 點樣

它是血清蛋白電泳的關(guān)鍵步驟，也是最容易出問題的環(huán)節(jié)。若點樣量過小，電泳圖譜的顯色就不明顯；點樣量過大，電泳條帶會變寬，使電泳條帶不易清晰分離。應(yīng)根據(jù)實驗條件不同，摸索出一個合適的點樣量。點樣時應(yīng)注意用鑷子從緩沖液中輕輕取出浸泡好的醋酸纖維素薄膜，要置于潔凈的濾紙上輕輕吸去多余的水分（切勿用力擠壓），以使薄膜保持濕潤狀態(tài)。如果這時看到薄膜表面有白斑，說明該薄膜質(zhì)地不均勻，會影響電泳效果，應(yīng)棄之。

3.3 電泳

將點好樣的薄膜的點樣端平貼在電泳槽陰極端的濾紙橋上，薄膜的另一端平貼在電泳槽陽極端的濾紙橋上。點樣線不能與濾紙橋接觸，以防止樣品擴(kuò)散，影響實驗效果。薄膜與濾紙橋接觸處應(yīng)貼緊，二者之間不能有氣泡殘留。薄膜應(yīng)懸空繃直，中間不能下垂。電泳前需平衡10min左右，其目的是使緩沖液完全浸潤薄膜，以達(dá)到平衡狀態(tài)。電泳剛開始時，電壓選擇應(yīng)稍微低一點，本研究選用60 V電壓電泳5min，然后再將電壓調(diào)高到95 V，再電泳55min。

3.4 染色

用氨基黑10 B-甲醇溶液染色，染色時間以薄膜內(nèi)呈現(xiàn)清晰蛋白條帶時為準(zhǔn)，適宜5～8min（若染色時間過長，薄膜底色不易脫去；染色時間過短，著色淺，不易觀察與拍照）。將染好色的薄膜放入漂洗液中反復(fù)漂洗，使其背景色基本脫掉。但要特別注意用過的漂洗液不可倒掉，可經(jīng)過活性炭吸附有機(jī)色素后循環(huán)使用，這樣可以節(jié)約大量試劑，大大降低實驗成本。

［1］ 周麗亞，高靜，吳兆亮，等.血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗的改進(jìn)[J].生物學(xué)雜志，2008，25（2）：67-68.

［2］ 蔡杰，劉蕓.醋酸纖維薄膜電泳法分離測定雞血清蛋白質(zhì)[J].貴州大學(xué)學(xué)報，2005，2（7）：125-128.

［3］ 陳巍，龔偉宏.寧夏灘羊血清蛋白組分含量的研究[J].中國草食動物，2003（專輯）：70-71.

［4］ 劉建強(qiáng)，孟青妹.青海蟾蜍血清蛋白質(zhì)成分的電泳分析[J].中國獸醫(yī)科技，2003，33（10）：64-65.

［5］ 劉維全，高士爭，劉芃芃，等.動物生物化學(xué)實驗指導(dǎo)（3版）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2008：95-97.

［6］ 廖飛，王詠梅，左渝萍，等.點樣位置對血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳行為的改變[J].實驗室研究與探索，2004，23（4）：17-23.