HPLC法同時測定飼料預混料中維生素C（VC）和VC磷酸酯的含量

湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院 張春艷

廣東海大集團畜牧水產(chǎn)研究中心 周孝治*

維生素C（VC）又稱L-抗壞血酸，是動物生長發(fā)育過程中不可缺少的營養(yǎng)素之一（張輝等，2009），其結(jié)構(gòu)中存在易氧化基團，在飼料加工、儲藏和使用過程中穩(wěn)定性較差（葛建東和楊凌，1998）。實際應(yīng)用中，常將VC酯化為穩(wěn)定的VC磷酸酯，但由于其酯化程度及加工工藝不同，飼料添加劑或預混料中VC磷酸酯常為單體VC和VC磷酸酯的混合物，因而其穩(wěn)定性或利用率存在差異（張瑋和尚平，2005）。

目前飼料添加劑中VC檢測主要采用氧化還原滴定法和鄰苯二胺熒光法，VC磷酸酯檢測主要采用酶解法和紫外分光光度法。由于飼料預混料中干擾物質(zhì)較多，采用這些方法操作步驟復雜，且不能區(qū)分單體VC和VC磷酸酯的含量，因而對不同廠家生產(chǎn)的飼料預混料中VC含量容易產(chǎn)生誤判（張麗萍和吳小春，2002）。本文旨在建立飼料預混料中VC和VC磷酸酯含量同時測定的高效液相色譜（HPLC）法，以期獲得簡單快速、干擾少、回收率高、檢測結(jié)果準確可靠的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Agilent1200型高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器（DAD），Agilent Chem-Station色譜工作站；HERMLE-Z323型高速離心機；Sartorius-CP225D型電子分析天平；SCQ-3201A超聲波清洗儀。

VC標準品（Dr.Ehrenstorfer公司，純度 ≥99.0%），VC磷酸酯鈉鹽標準品（Fluka公司，純度≥ 98.0%），乙腈為色譜純，磷酸二氫鉀、磷酸為分析純，實驗用水為Millipore超純水。

1.2 溶液配制 磷酸緩沖液的配制：準確稱取40.83 g磷酸二氫鉀用超純水溶解稀釋至1000 mL，用85%磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0，然后用0.45 μm濾膜過濾，配制成0.3 mol/L磷酸二氫鉀（pH 4.0）的緩沖溶液。

混合標準儲備液的配制：準確稱取VC和VC磷酸酯鈉鹽標準品各100.00 mg于100 mL棕色容量瓶中，用磷酸緩沖液溶解并定容至刻度，即成1000.0 mg/L的VC和VC磷酸酯鈉鹽混合標準儲備液，于4℃冰箱避光保存。

1.3 試驗樣品 飼料預混料，由廣東某研究中心提供。

1.4 試驗方法

1.4.1 色譜分析條件 色譜柱：Lichrospher-NH2分析柱（250 mm×4.0 mm i.d.，5 μm）；流動相：乙腈-磷酸緩沖液（30∶70，V/V）；檢測器：DAD 檢測器，檢測波長為 254 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL；流速：1.0 mL/min。

1.4.2 樣品的預處理 稱取樣品0.5～1 g（精確至0.0001 g）于100 mL棕色具塞三角瓶中，加入流動相50 mL，搖勻，于25℃水浴超聲提取15 min，冷卻靜置2 min，取上層提取液約30 mL轉(zhuǎn)入離心管中，以4000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm微孔濾器過濾，進HPLC分析。

1.4.3 標準曲線的繪制 用流動相將VC和VC磷酸酯鈉鹽混合標準儲備液逐級稀釋得到濃度為5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L 和 200.0 mg/L 的一系列標準工作液，在選定的色譜條件下，將濃度由低到高進樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標準曲線回歸方程。

1.4.4 樣品的測定 按外標法，將各試樣經(jīng)HPLC檢測所得的VC和VC磷酸酯鈉鹽色譜峰面積分別代入相應(yīng)的標準曲線方程，得到樣品中VC和VC磷酸酯鈉鹽的含量，其中VC磷酸酯鈉鹽含量再乘以VC磷酸酯鈉鹽轉(zhuǎn)換為VC磷酸酯的系數(shù)0.7951，求得樣品中VC磷酸酯的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品預處理條件的選擇

2.1.1 提取液的選擇 由于VC和VC磷酸酯屬于極性化合物，其中VC溶液熱穩(wěn)定性較差，在中性或堿性水溶液中易被氧化，但在酸性溶液中比較穩(wěn)定，實驗過程中分別用磷酸緩沖液（pH 4.0）和流動相作為提取液，考察了提取液對試樣提取的影響。結(jié)果顯示，采用流動相作為試樣提取液時提取效果良好，且色譜峰形尖銳對稱，因此選用流動相作為試樣提取液。

2.1.2 提取條件的選擇 實驗選用流動相作為試樣提取液，對提取溫度（25、35、45、50 ℃）和提取時間（5、10、15、20 min） 兩個條件參數(shù)進行了優(yōu)化。結(jié)果表明：隨著溫度的升高，VC磷酸酯的提取效率加快，但單體VC的穩(wěn)定性減弱；隨著提取時間的增加，試樣提取效率有所增加，當提取時間超過15 min時，提取液中雜質(zhì)干擾增多，最終確定參數(shù)為：提取溫度25℃，提取時間15 min。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 檢測波長的選擇 采用流動相作為背景緩沖液，對VC和VC磷酸酯標準液和樣品溶液用二極管陣列檢測器在190～400 nm進行全波長紫外掃描。結(jié)果表明，VC和VC磷酸酯兩種物質(zhì)在254 nm處相對吸收最大，且雜峰干擾少，本實驗選擇檢測波長為254 nm。

2.2.2 色譜柱的選擇 考察了 C18、C8和 NH2分析色譜柱對VC和VC磷酸酯分離效果的影響，由于VC和VC磷酸酯極性較強，在C18和C8分析柱上保留時間短，不能很好的與雜峰分離，但在具有極性官能團的NH2色譜柱上，VC、VC磷酸酯與雜峰之間分離效果良好，相對保留時間較長，故選擇NH2色譜柱作為分離柱。

2.2.3 流動相的選擇 由于VC在酸性介質(zhì)中比較穩(wěn)定，實驗過程中考察了流動相磷酸緩沖液不同 pH 值（3.0、4.0、5.0）對色譜分離效果的影響。結(jié)果表明pH為4.0時，VC和VC磷酸酯吸收值較大，靈敏度高，色譜峰形對稱，因此緩沖液pH選擇為4.0。

實驗過程中還分別通過調(diào)節(jié)磷酸緩沖液不同濃度（0.1、0.2、0.3 mol/L）和乙腈-磷酸緩沖液不同比例（20∶80、30∶70、40∶60，V/V）來改善色譜峰的分離效果。結(jié)果顯示，隨著磷酸緩沖液濃度的升高，色譜峰形和分離度越好；隨著乙腈比例的升高，保留時間縮短，雜質(zhì)干擾較大。當乙腈-磷酸緩沖液（0.3 mol/L）比例為 30∶70（V/V）時，目標峰與樣品中的雜峰分離良好，色譜峰形尖銳、對稱（見圖1），在此色譜條件下VC和VC磷酸酯的保留時間分別為（4.10±0.05）min 和（8.12±0.05）min。

圖1 不同樣品中VC和VC磷酸酯的高效液相色譜圖

2.3 標準曲線和方法檢出限 在上述色譜條件下， 對 5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 mg/L 和 200.0 mg/L的VC和VC磷酸酯混合標準工作液進樣分析，以HPLC測得的峰面積為縱坐標（y），相應(yīng)的濃度為橫坐標（x）繪制標準曲線，得出VC和VC磷酸酯的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，根據(jù)3倍信噪比（S/N=3）可計算出方法的檢出限，結(jié)果見表1。試驗結(jié)果表明，濃度為5.0～200.0 mg/L時，VC和VC磷酸酯線性關(guān)系良好，檢出限分別為0.05 mg/L和0.1 mg/L。

表1 VC和VC磷酸酯的線性回歸方程及檢出限

2.4 方法的準確度和精密度 對未添加VC和VC磷酸酯的空白飼料預混料進行加標樣品回收率和精密度實驗，選擇了 100.0、1000.0、5000.0 mg/kg三個添加水平，每個濃度平行測定5次，重復3 d，結(jié)果見表2。

從表2中的數(shù)據(jù)可以看出，添加濃度為100.0～5000.0 mg/kg時，飼料預混料樣品中VC和VC磷酸酯的平均回收率為95.6%～99.1%，日內(nèi)相對標準偏差為0.97%～1.76%，日間相對標準偏差為1.98%～3.84%，方法檢測的準確度和精密度良好，滿足分析的要求。

表2 飼料預混料中VC和VC磷酸酯的回收率和精密度測定

2.5 樣品測定 按本文所建立的方法測定了A、B、C、D、E五種不同飼料預混料樣品中VC和VC磷酸酯的含量，將VC磷酸酯含量轉(zhuǎn)換為VC含量（VC磷酸酯轉(zhuǎn)換為VC的系數(shù)按0.6876計），與所測單體VC含量之和得到總VC含量。結(jié)果如表3所示，五種不同飼料預混料添加的總VC含量大致相同，約為5500 mg/kg，但其中單體VC含量和VC磷酸酯含量卻各不相同，存在較大差異。

表3 不同飼料預混料中VC、VC磷酸酯和總VC含量

3 結(jié)論

采用高效液相色譜法檢測飼料預混料中VC和VC磷酸酯含量，其檢測結(jié)果準確度高，平均回收率在95.6%～99.1%，重現(xiàn)性好，日內(nèi)相對標準偏差在0.97%～1.76%，日間相對標準偏差在1.98%～3.84%，樣品的預處理簡單快速，不受樣品中其他組分的干擾，適用于飼料預混料中VC和VC磷酸酯的快速定量分析測定。

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