應(yīng)用全骨髓貼壁法獲取高純度大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的實驗研究

盧 寧, 趙龍鳳, 李 紅, 郝彥琴, 黃麗麗 (山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院感染科, 太原 030001; 通訊作者,Tel:0351-4639004)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)因其具有強(qiáng)大的多向分化潛能及自我更新能力,且由于其易于分離培養(yǎng)擴(kuò)增的特性而日益受到關(guān)注[1-3]。但骨髓中的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)含量極低,每 10萬個單個核細(xì)胞中大約只有 1個 MSC[3]。因而,本實驗旨在探討適宜的方法在體外獲得大量優(yōu)質(zhì)的 BMSCs,以使其更好地服務(wù)于基礎(chǔ)及臨床研究。

圖4 BMSCs表型的免疫細(xì)胞化學(xué)染色 (×400)Fig 4 Immunocytochem istry of phenotype of BMSCs(×400)

1 材料和方法

1.1 實驗動物及試劑 清潔級健康雄性 Wistar大鼠(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)。實驗試劑:DMEM-F12培養(yǎng)基(美國 Hyclone公司);胎牛血清(中國杭州四季青生物公司);胰蛋白酶(美國 sigma公司);兔抗大鼠 CD34、CD44、CD45(中國北京博奧森公司);3110型 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國 Thermo公司);CKX41型倒置顯微鏡(日本 OLYMPUS);SWCJ-IFD超凈工作臺(中國蘇凈集團(tuán)安康公司);KDC-40低速離心機(jī)(中國科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司);流式細(xì)胞儀(美國 Becton Dickinson公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的體外分離及原代培養(yǎng) 取清潔級健康雄性 Wistar大鼠,體重約 150 g,脫臼處死。首先用 75%酒精浸泡消毒 5min,然后用已提前消毒的手術(shù)器械無菌分離四肢長骨,去除骨膜及殘留肌肉,剪去長骨兩端,暴露髓腔后用注射器吸取 DMEM液反復(fù)沖洗骨髓腔,收集沖洗液,離心(1 200 r/min,共 10min),棄上清。用含 20%胎牛血清的 DMEMF12培養(yǎng)基反復(fù)吹打重懸細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,計數(shù)后以 1×109/ml密度接種于培養(yǎng)瓶(25 cm2),標(biāo)記為 P0,置于 37℃、5%CO2孵箱內(nèi),旋開半檔瓶蓋培養(yǎng)。24 h后進(jìn)行半量換液,以后每 2-3 d換液,棄去未貼壁細(xì)胞以達(dá)到純化的目的,當(dāng)貼壁細(xì)胞長到 80%融合時結(jié)束原代培養(yǎng)。

1.2.2 BMSCs傳代擴(kuò)增 原代細(xì)胞達(dá) 80%融合時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液倒掉,再用PBS液沖洗 2次以除去殘留血清,每瓶加入 0.25%胰酶 2ml進(jìn)行消化,在鏡下觀察可見細(xì)胞皺縮,體積逐漸變小,此時終止消化,消化時間約 2-3 min,進(jìn)行吹打以吹落貼壁細(xì)胞,移入離心管后進(jìn)行離心(1 200 r/min,共 5 min),棄上清。用含 10%胎牛血清的 DMEM-F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后接種于培養(yǎng)瓶,標(biāo)記為 P1,按 1∶2比例進(jìn)行傳代。以后 2-3 d換液。重復(fù)上述步驟進(jìn)行 P2、P3及 P4代的傳代培養(yǎng)。

1.2.3 觀察細(xì)胞形態(tài) 采用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察,并拍照。

1.2.4 測定 BMSCs細(xì)胞生長曲線 取生長狀態(tài)良好的 P3代細(xì)胞,以 PBS液沖洗 2遍后用 0.25%胰酶消化貼壁細(xì)胞,終止后用吸管反復(fù)吹打制成細(xì)胞懸液,再按 1.3×105/ml接種于 24孔板,每日取 2孔進(jìn)行計數(shù),取平均值,連續(xù)計數(shù)12 d。以時間為橫坐標(biāo),細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo),繪制生長曲線。

1.2.5 BMSCs細(xì)胞周期測定 取 P3代細(xì)胞,PBS液沖洗后用胰酶消化,用 PBS液制成單細(xì)胞懸液,離心(1 200 r/min,共 5 min),重復(fù) 2次,用 75%冷乙醇固定,離心后棄去上清加入 PI染液避光孵育30min,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期,重復(fù) 3次。

1.2.6 BMSCs細(xì)胞表型鑒定 取生長狀態(tài)良好的P3代細(xì)胞,制成細(xì)胞爬片,用 95%乙醇固定 30min,3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶,0.1%TritonX-100通透,10%BSA封閉,將一抗 (兔抗大鼠 CD34、CD44、CD45)分別加于不同的切片上 4℃過夜,同時用 PBS作為空白對照。次日加生物素化二抗后37℃下孵育 30min,加 SABC,DAB顯色,蘇木素復(fù)染、脫水封片后觀察。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長情況 取大鼠骨髓培養(yǎng)的原代細(xì)胞,接種后鏡下觀察顯示,細(xì)胞大小均一,呈圓形,胞體透亮。24 h進(jìn)行第一次換液,除去未貼壁細(xì)胞。培養(yǎng) 3-5 d后,可見大多數(shù)細(xì)胞貼壁,并逐漸伸出偽足,呈圓形或多邊形,胞核位于細(xì)胞中央,集落生長,此時細(xì)胞增長迅速,于培養(yǎng) 7-10 d細(xì)胞漸漸鋪滿培養(yǎng)瓶,達(dá)到 80%融合后結(jié)束原代培養(yǎng),進(jìn)行傳代擴(kuò)增。傳代培養(yǎng)的細(xì)胞,貼壁較原代迅速,24 h即完全貼壁,大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)多呈長梭形,體積較大,增殖迅速,約 5-7 d后再次增殖,見圖 1。

圖1 BMSCs的形態(tài)學(xué)變化Fig 1 Themorphological changes of BMSCs

2.2 BMSCs生長曲線 細(xì)胞培養(yǎng)第4天時開始迅速增長,進(jìn)入指數(shù)增生期,6 d后進(jìn)入平臺期,見圖 2。

2.3 BMSCs細(xì)胞周期 經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)行細(xì)胞周期檢測,P3代 BMSCs處于 G0/G1期的細(xì)胞為 81.49%,G2期的細(xì)胞為 8.33%,S期的細(xì)胞為 10.10%,這說明大多數(shù)細(xì)胞處于靜止期,符合干細(xì)胞的特征,見圖 3。

2.4 BMSCs細(xì)胞表型鑒定 經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定結(jié)果顯示,CD44陽性,CD34、CD45陰性,見圖 4(見封3)。

圖2 BMSCs生長曲線Fig 2 The growth curve of BMSCs

圖3 P3代BMSCs細(xì)胞周期流式圖Fig 3 The cell cycle of P3BMSCs by flow cytometry

3 討論

3.1 獲得較高純度 BMSCs的意義 BMSCs最先由Friedenstein等[4]發(fā)現(xiàn),并于 1974年首次成功于體外分離培養(yǎng)獲得。經(jīng)大量研究證實,BMSCs可以在不同誘導(dǎo)條件下分化為中胚層及神經(jīng)外胚層組織細(xì)胞,如心肌細(xì)胞、肝細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等[5-7],因而 BMSCs是目前基礎(chǔ)及臨床研究中的熱點。由于骨髓中的 MSCs含量極少,并隨年齡的增長而減少,獲得較高純度的 BMSCs對于進(jìn)一步研究具有重要的意義。

3.2 選擇全骨髓貼壁法獲取 BMSCs的原因 目前體外獲得 BMSCs的方法主要有全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分離法以及免疫磁珠分選法,因其各具優(yōu)缺點,所以國內(nèi)外學(xué)者在選取何種方法可以經(jīng)濟(jì)、簡便地獲取較高純度的 BMSCs方面并未達(dá)成一致[8]。密度梯度離心法是一種根據(jù)骨髓中MSCs與其他細(xì)胞的密度不同而采用 Ficoll及 Percoll分離液進(jìn)行分離,從而獲得 MSCs的方法。雖然此法對細(xì)胞活性影響小,但容易造成大量細(xì)胞的流失,且操作復(fù)雜。全骨髓貼壁法是根據(jù) BMSCs的貼壁特性通過定期換液除去不貼壁的細(xì)胞,如造血系細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等,以達(dá)到分離純化的目的。該法操作簡便,可以獲取純度較高的 BMSCs,較其他方法節(jié)省費(fèi)用,并可最大程度地減少污染的機(jī)會。本實驗應(yīng)用全骨髓貼壁法在體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,傳代擴(kuò)增至 3代以后在倒置顯微鏡下觀察,大多數(shù)細(xì)胞形態(tài)呈長梭形,并呈集落樣生長。經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)方法鑒定其表面標(biāo)志,結(jié)果顯示 CD44為陽性,而 CD34及 CD45造血干細(xì)胞表面標(biāo)志則為陰性,說明在此法下獲取了較高純度的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,為進(jìn)一步進(jìn)行基礎(chǔ)及臨床研究提供基礎(chǔ)。

3.3 培養(yǎng)條件的選擇 在分離培養(yǎng)過程中,培養(yǎng)條件是獲得較高純度 BMSCs的關(guān)鍵。首先是細(xì)胞培養(yǎng)基的選擇。王文等[9]在比較不同分離方法及培養(yǎng)條件下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生長增殖情況的研究中,分別選用 DMEM-F12培養(yǎng)基及 DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),結(jié)果發(fā)現(xiàn)活細(xì)胞率分別為 97.7%及97.1%,因而在進(jìn)行 BMSCs培養(yǎng)時以 DMEM-F12培養(yǎng)基為佳,這可能與 DMEM-F12培養(yǎng)基既具有DMEM的營養(yǎng)成分含量高的特點,又具有 F12含更多非必需氨基酸及維生素的特點有關(guān)。因而本實驗選用 DMEM-F12作為培養(yǎng)基,在細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)胞的生長狀態(tài)較好,利于獲得數(shù)量較多的 BMSCs。其次是傳代時消化時間的掌握。全骨髓貼壁法不僅要根據(jù)不同細(xì)胞的貼壁性來去除雜質(zhì)細(xì)胞,也通過細(xì)胞所需消化時間的不同來達(dá)到純化的目的。在培養(yǎng)過程中,成纖維細(xì)胞的貼壁性好,形態(tài)與 BMSCs類似,很難通過換液去除,但其所需消化時間比 BMSCs長,故可以在傳代時通過胰酶消化時間的長短來達(dá)到純化的目的。我們在實驗過程中不斷探索發(fā)現(xiàn),在傳代時,每瓶細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)約 105/瓶)需要 0.25%胰酶約 2-3ml,待細(xì)胞稍見回縮、形態(tài)改變即終止消化,時間約為 2 min,這樣不僅可以有效地去除成纖維細(xì)胞而得到較純的 BMSCs,同時也可以維持細(xì)胞的活性。此外,細(xì)胞的接種密度對于 BMSCs的生長具有重要意義。當(dāng)細(xì)胞接種密度過大,細(xì)胞的生長空間受到限制,不利于生長;而接種密度過小時,細(xì)胞又容易老化。因而,在原代培養(yǎng)時,應(yīng)掌握適當(dāng)?shù)慕臃N密度。莊淑波等[10]比較不同接種密度對細(xì)胞生長的影響時發(fā)現(xiàn) 1×109/ml組細(xì)胞出現(xiàn)伸展的時間及原代培養(yǎng)細(xì)胞融合時間較其他密度組要早,因而本實驗在原代培養(yǎng)時按 1×109/ml接種,在培養(yǎng) 3-5 d細(xì)胞即貼壁并逐漸伸出偽足。

本實驗分離培養(yǎng)所得的 BMSCs在鏡下觀察可見其呈長梭形,體積較大,單核,呈集落樣及吹風(fēng)樣生長。選取生長狀態(tài)良好的 P3代細(xì)胞測定細(xì)胞生長曲線顯示細(xì)胞在培養(yǎng)的第 4-5天迅速增長,進(jìn)入指數(shù)增生期,7-10 d后進(jìn)入平臺期。在增殖過程中,干細(xì)胞處于相對靜止?fàn)顟B(tài),由短暫擴(kuò)充細(xì)胞完成DNA合成和細(xì)胞擴(kuò)充任務(wù)[11]?；谶@一特性,本研究對 P3代 BMSCs行細(xì)胞周期檢測,結(jié)果顯示,81.49%的細(xì)胞處于 G0/G1期,G2期的細(xì)胞為8.33%,S期的細(xì)胞為 10.10%,表明絕大多數(shù)細(xì)胞處于相對不活躍的靜止期,這與BMSCs的基本特征相符。對分離的 BMSCs行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定其表型,結(jié)果顯示,CD44為陽性,CD34及 CD 45均為陰性,與 BMSCs的表型特征相符合。由此可知,本實驗室應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)法獲得的細(xì)胞從形態(tài)、生長動力學(xué)及細(xì)胞表型上均符合 BMSCs特征,對進(jìn)一步利用 BMSCs進(jìn)行基礎(chǔ)及臨床研究具有重要意義。

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