保肝湯對酒精性脂肪肝大鼠肝脂質過氧化和 CYP2E1表達的影響

江國榮 張露蓉 嚴 煒 任光榮 南京中醫(yī)藥大學附屬蘇州市

中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,中藥研究所(蘇州215003)

酒精性肝病在我國的發(fā)病率迅速增加,已成為危害國民健康的重大疾病。M ANN.R.E[1]等調查顯示:重度飲酒者中80%有一定程度的酒精性脂肪肝,其中10%～ 35%可發(fā)展成酒精性肝炎和酒精性肝硬化[2]。酒精性脂肪肝肝臟損傷初期,也是臨床防止該病病情進一步發(fā)展的重要環(huán)節(jié),目前對酒精性脂肪肝的治療仍以戒酒、營養(yǎng)支持為主。本文在中醫(yī)臨床驗方保肝湯對酒精性脂肪肝具有防治作用的基礎上,進一步從肝脂質過氧化和 CYP2E1表達角度,探討保肝湯防治酒精性脂肪肝的作用機制,從而為提高臨床療效提供進一步的依據(jù)。

1 材 料 1.1 儀器 5810R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);FSH-2A可調高速均漿機(江蘇金壇市醫(yī)療儀器廠);GeneAmP2400型 PCR儀 (美國 Perkin Elmer公司);Power PAC2000電泳儀 (Biorad公司);數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)(GIS2008H)(上海天能科技有限公司)。

1.2 試藥 保肝湯(丹參、山楂、葛根、決明子、三七等 ,飲片由蘇州春暉堂飲片廠提供,由本實驗室提取為相當于 1g生藥?mL-1的提取液);硫普羅寧片(河南省新誼藥業(yè)股份有限公司 ,國藥準字號 H10980086);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶 (SOD)試劑盒 (南京建成生物工程研究所);兔抗鼠 CYP2E1試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);免疫組化生物二抗試劑盒(上海基因科技有限公司);Trizol(美國 Invitrogen公司);RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas公司);自制飼料:采用普通飼料:豬油=85:15,充分混勻,制成成型飼料。

1.3 動物 清潔級 Wistar大鼠 ,雄性,體重 180±20g,購于浙江省實驗動物中心。

2 方 法 2.1 大鼠酒精性脂肪肝模型的建立 參照文獻[3]建立酒精性脂肪肝大鼠模型:前 3d以 15% (體積比 )白酒代替水給予飲用 ,第4天起按15mL? kg-1灌服52%(體積比)白酒,每日 1次;同時給予自制飼料,自由飲水。至第 4周末,形成酒精性脂肪肝模型。

2.2 動物分組與給藥 取 Wistar大鼠,雄性,56只,隨機分為 7組(n=8),分別設為以下組別:空白對照組:以同等劑量NS灌胃 8周;模型組:按 2.1方法造模 (4周)后,以 NS灌胃至 8周;保肝湯低、中、高三個劑量治療組:按 2.1方法造模 (4周 )后 ,以 3.30g、7.50g、15.00g生藥? kg-1灌胃至 8周;保肝湯防治組:按 2.1方法造模的同時,灌胃給予 7.50g生藥? kg-1至 8周;硫普羅寧治療組:按 2.1方法造模 4周后,以 40mg? kg-1灌胃至 8周[4]。 灌胃量均為 15mL? kg-1折算。

2.3 指標檢測方法 在8周末處死大鼠。處死前禁食12h,以 2%戊巴比妥鈉溶液 1mL? kg-1體重腹腔內(nèi)注射麻醉[5],迅速取出肝臟,按常規(guī)制備肝勻漿、肝組織石蠟切片標本,部分肝組織于-80℃低溫保存。肝組織中 SOD活力和 MDA含量按試劑盒步驟測定,并以考馬斯亮蘭法測定組織總蛋白的含量;肝組織中 CYP2E1采用 SABC法檢測[6],依照試劑盒步驟進行操作;以 TRIzol法抽提肝組織中的總 RN A,RT-PCR根據(jù)逆轉錄反應試劑盒步驟操作;用數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)對 RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶行密度分析,測定目的帶及CYC條帶的V值(Volume=平均吸光密度值×條帶面積),目的條帶表達強度 RV=V目的帶 /CYC。

3 結 果 3.1 保肝湯對肝組織中M DA、SOD的影響模型組與空白對照組相比,MDA含量明顯升高(P＜0.05),SOD活力明顯降低(P＜0.05);保肝湯高、中劑量組、防治組和硫普羅寧組的 MDA含量較模型組明顯降低(P＜0.05),SOD活力較模型組明顯升高(P＜0.05);其中 MDA指標保肝湯中劑量組最好(與空白對照組比較 P＞0.05),SOD指標保肝湯中、高劑量組優(yōu)于低劑量組 ,但防治組效果最好(與空白對照組比較 P＞ 0.05),見表 1。

表1 各組大鼠肝組織中MDA、SOD的比較(±s,n=8)

表1 各組大鼠肝組織中MDA、SOD的比較(±s,n=8)

與空白對照組比較:△P＜0.05,▲P＜0.01;與模型組比較:◇P＜0.05,◆P ＜0.01

組別 給藥劑量(?kg-1)MDA含量(nmol?mg Prot-1)SO D活力(U?mgProt-1)空白對照組 - 2.22± 0.71 201.94±20.26模型組 - 3.37± 1.66△ 178.48± 17.40▲保肝湯低劑量組 3.30 g生藥 2.74±1.18 183.62±17.44保肝湯中劑量組 7.50 g生藥 2.25±0.50◇ 197.03±9.49◇保肝湯高劑量組 15.00 g生藥 2.49±0.52 196.68±16.61◇保肝湯防治組 7.50 g生藥 2.35±0.31◇ 203.23±18.55◆硫普羅寧組 60mg 2.17± 0.79◇ 197.90± 18.67◇

3.2 保肝湯對肝組織 CYP2E1表達的影響 光鏡下顯示:空白對照組肝組織胞漿中染成棕黃色顆粒的 CYP2E1的表達局限,僅于中央靜脈周圍的少數(shù)幾個肝細胞,不超過2～ 3個細胞層的厚度;模型組可見 CYP2E1表達的強度增強,出現(xiàn)大量深染的棕黃色陽性顆粒,呈彌散性分布,其分布與肝細胞脂肪變的分布具有一致性 (與空白對照組比較 P＜0.01)(圖 1);各藥物組的 CYP2E1的表達分布方式也呈彌散性,但強度受到不同程度的抑制(與模型組比較P＜0.01),保肝湯中劑量組和防治組效果最佳(與空白對照組比較 P＞0.05),僅見少量CYP2E1表達 (圖 2、 3),結果見表 2。

3.3 保肝湯對 CYP2E1/CYCmRN A表達的影響 凝膠電泳和數(shù)據(jù)圖像處理結果顯示,CYP2E1mRN A表達,模型組比空白對照組表達增強(P＜0.01);各給藥組均較模型組其表達均有不同程度降低(P＜0.01),結果見表 3和圖 4。

表2 各組CYP2E1免疫組化結果比較(n=8)

圖1 CYP2E1在模型組肝組織細胞漿中的表達(×200)

圖2 CYP2E1在防治組肝組織細胞膜和細胞漿中的表達(×200)

圖3 CYP2E1在中劑量肝組織細胞漿中的表達 (×200)

表3 各組大鼠 CYP2E1/CYCm RNA表達(n=3)

圖4 各組大鼠CYP2E1mRN A表達1:模型組;2:空白對照組;3:防治組;4:低劑量組;5:中劑量組;6:高劑量組。

4 討 論 中醫(yī)學認為,過量飲酒,酒毒濕熱之邪蘊積中焦,傷及脾胃,脾胃失運,濕濁內(nèi)生,濕熱蘊結,或停于脘腹,或阻于脅下,而出現(xiàn)胃痞、傷酒、脅痛等證。酒傷肝脾,聚濕生痰,痰濕瘀毒互結為本病之關鍵病機,宜以祛濕化痰、活血化瘀等法貫穿治療的始終。現(xiàn)代實驗研究也表明,中醫(yī)中藥在預防和治療酒精性脂肪肝方面顯示出較好的優(yōu)勢。保肝湯由丹參、山楂、葛根、決明子、三七等藥組成,組方精煉,藥少力專 ,具化瘀祛痰功效,治療酒精性肝病 ,尤其是酒精性脂肪肝,取得了良好的臨床效果。前期實驗結果(另文發(fā)表)也顯示,保肝湯能明顯減輕模型鼠肝組織細胞的脂肪變性,起到保護、恢復肝臟功能的作用。

氧化應激與脂質過氧化在酒精性脂肪肝的形成中有重要作用[7]。乙醇及其代謝產(chǎn)物可對機體的氧化-還原反應造成影響,誘導超氧陰離子的生成,消耗自由基清除劑還原型谷胱甘肽(GSH),降低細胞中 GSH的水平,從而使血清自由基增多,氧化肝細胞膜的多不飽和脂肪酸和蛋白質,形成脂質過氧化物(LPO),致肝細胞結構和功能的損害。丙二醛(M DA)是重要的脂質過氧化產(chǎn)物,對組織細胞有很強的毒性作用,可作用于核因子 N F-κB,結果使致炎因子表達釋放增加;還可與 Kupffer細胞及肝細胞釋放的細胞因子一起進一步介導肝細胞損傷,從而使肝臟炎癥進一步加重[8];使細胞膜的流動性和通透性發(fā)生障礙,最終導致肝細胞結構與功能損害。因而MDA的含量可反映組織過氧化損傷程度[9],間接反映細胞的損傷情況。SOD可以通過歧化作用清除體內(nèi)氧自由基,從而減少脂質過氧化反應,維持生物膜的正常結構和功能,其水平高低反應了機體抗氧化能力的強弱。徐中南等[10]研究顯示,對酒精性脂肪肝大鼠用藥后,明顯提高肝組織 SOD活性,降低 M DA含量,其部分機制抗脂質過氧化和增加脂質代謝有關。聯(lián)合檢測SOD活力及MDA含量,能間接反映機體脂質過氧化反應對組織的損傷程度。本實驗結果顯示:模型組大鼠 SOD活性明顯降低,M DA含量明顯升高,說明灌服白酒的大鼠體內(nèi)氧自由基生成增多,脂質過氧化情況嚴重,因而肝臟損傷明顯。保肝湯中、高劑量組、防治組和硫普羅寧組較模型組明顯改善,其中保肝湯中劑量組和防治組效果最好(與空白組相似),而低劑量組對 SOD、M DA影響與模型組無明顯差異,表明復方藥物的劑量及療程對藥物發(fā)揮作用可能存在影響。

乙醇在肝內(nèi)主要通過三個酶系統(tǒng)被氧化:乙醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase,ADH)、微粒體乙醇氧化酶系統(tǒng)(micro-somal ethanol-oxidizing system,MEOS)和過氧化物酶體中的過氧化物酶。M EO S是一組混合功能氧化酶系,其催化作用有賴于細胞色素 P450的參與,與酒精代謝密切相關的為細胞色素 P4502E1(CYP2E1)[11]。其在酒精的氧化代謝產(chǎn)生自由基和啟動脂質過氧化過程及肝臟損害中起著重要的作用[12]。乙醇可以提高 CYP2E1的基因和蛋白表達,激活磷脂酶及脂質過氧化反應。當血液中的乙醇含量超過 10%時,M EOS系即將參與乙醇的氧化過程。CYP2E1具有很強的N ADPH氧化活性,能氧化乙醇生成乙醛,產(chǎn)生大量活性氧中間產(chǎn)物并激活Kupffer細胞釋放炎癥因子 ,使反應性氧增多;隨著 CYP2E1表達的增強,SOD、GSH、VitE的含量均顯著下降。由于脂質過氧化反應的增強而抗氧化能力的下降,導致自由基的生成增多,進一步促進脂質過氧化反應,使M DA生成增加,最終導致肝細胞結構與功能的損害。研究發(fā)現(xiàn),CYP2E1表達隨脂肪肝程度的加重,表達逐漸增高[13]。 CYP2E1抑制劑可以對抗由于乙醇、游離脂肪酸等誘導的 CYP2E1過表達而致的氧應激和脂質過氧化[14],因而尋找安全有效的CYP2E1抑制劑可能成為預防和治療脂肪性肝病的一條新途徑。本研究肝組織CYP2E1免疫組化結果顯示,空白組大鼠肝組織切片中染成棕黃色顆粒的CYP2E1主要分布于中央靜脈周圍的少數(shù)肝細胞,模型組大鼠有強烈表達,以發(fā)生脂肪變的肝細胞更為明顯,各用藥組表達強度及范圍均顯著減少,保肝中劑組及防治組效果最佳,僅見少量CYP2E1表達。RT-PCR測定CYP2E1mRNA表達顯示:模型組 CYP2E1mRNA與空白組比較表達顯著增加,各用藥組CYP2E1mRN A表達與模型組比較顯著降低,其中也以保肝防治組及中劑量治療組效果較好。綜合以上實驗結果說明:保肝湯能清除過多的自由基,阻斷氧自由基介導的脂質過氧化反應,阻止脂質過氧化物的產(chǎn)生,阻止肝細胞的脂肪變性和肝臟損傷,促進肝內(nèi)脂質代謝?？赡転楸８螠乐尉凭灾靖蔚淖饔脵C制之一;復方不同劑量及不同療程比較,提示保肝湯中劑量治療組效果較好,和由單一預防或治療為主轉向防治并用時效果更佳。

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