PepT1基因絕對(duì)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

李慧鋒,李麗,張麗娟,徐玉良,李武峰

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山西太谷 030801)

小肽跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是一種自然界普遍存在的現(xiàn)象,在人、動(dòng)物、細(xì)菌、真菌以及高等植物發(fā)芽種子中都有發(fā)現(xiàn)[1]。小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1是質(zhì)子依賴型轉(zhuǎn)運(yùn)載體,是動(dòng)物組織內(nèi)一個(gè)重要的生理過(guò)程,通常是通過(guò)動(dòng)物小腸進(jìn)行表達(dá)的[2]。

小肽對(duì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)有著特殊的意義,一方面在吸收過(guò)程中,小肽與游離氨基酸的吸收是兩個(gè)相互獨(dú)立的轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),與游離氨基酸相比,小肽具有吸收速度快、耗能低、不易飽和,且各種肽之間轉(zhuǎn)運(yùn)無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性與抑制性等特點(diǎn),有關(guān)資料表明在蛋白質(zhì)消化過(guò)程中,以肽形式存在的氨基酸濃度遠(yuǎn)比游離氨基酸存在的濃度大,而且肽的吸收速度也快[3～4]。另一方面它也可以提高動(dòng)物的生產(chǎn)性能,如改善肉質(zhì)、促進(jìn)動(dòng)物對(duì)礦物元素的吸收和利用,并為動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)家們配制高效的飼糧配方提供理論依據(jù),為進(jìn)一步改善飼糧蛋白質(zhì)的利用效率、節(jié)約蛋白質(zhì)資源開辟新的途徑。

小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與二肽和三肽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),二肽和三肽吸收是逆濃度進(jìn)行的,其轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)主要是依賴pH非耗能性Na+/H+泵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。質(zhì)子原動(dòng)力為小肽的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量,使之有別于其它物質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)而成為一種獨(dú)特的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,對(duì)于小肽的吸收利用具有重要作用。

為了測(cè)定雞腸道中的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體PepT1基因的絕對(duì)表達(dá)量,我們采用了SYBR Green模式的熒光定量PCR技術(shù)。該方法是利用熒光染料SYBR Green I與DNA雙鏈結(jié)合后釋放熒光的特點(diǎn)而建立的一種應(yīng)用較廣的熒光定量PCR技術(shù),它具有成本低,不需設(shè)計(jì)探針,且適合于高度變異基因的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[5],并可避免污染所導(dǎo)致的假陽(yáng)性發(fā)生。近年來(lái)發(fā)展很快,以其快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用到基因表達(dá)水平的實(shí)驗(yàn)分析中[6～9]。絕對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在樣本中的分子數(shù)目,即通常所說(shuō)的拷貝數(shù)。而相對(duì)定量的目的是測(cè)定目的基因在兩個(gè)或多個(gè)樣本中的含量的相對(duì)比例,而不需要知道它們?cè)诿總€(gè)樣本中的拷貝數(shù)。絕對(duì)定量的數(shù)據(jù)易于理解,而且清楚明了,最后用建立出的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量分析。

本研究旨在建立SYBR絕對(duì)熒光定量PCR來(lái)研究其腸道中PepT1基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)變化規(guī)律。采用雞小腸總 RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并經(jīng)過(guò)克隆PepT1基因的部分片段等步驟制備出熒光定量 PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,用于測(cè)定不同個(gè)體中PepT1基因mRNA表達(dá)的拷貝數(shù)。研究其腸道中PepT1基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期的表達(dá)變化規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用雞

選擇艾維茵肉雞,用于提取小腸組織總RNA。

1.1.2 儀器和試劑

臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),旋片式真空泵,PCR儀,熒光定量PCR儀,恒溫振蕩器,微量核酸測(cè)定儀。反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV,E.Z.N.A.TMPlasmid Mini KitⅠ,2×SYBR Premix EX TaqⅡ均由Takara公司生產(chǎn)。

1.1.3 引物

PCR克隆引物:上游引物ACTGTCAATCCAATCCTG,下游引物GACAGTCACGTTCTGAAGA,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為282 bp,引物由北京優(yōu)博基因科技有限公司合成。熒光定量PCR引物:上游引物CCCCTGAGGAGGATCACTGTT;下游引物CAAAAGAGCAGCAGCAACGA;擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為66 bp,該引物的擴(kuò)增產(chǎn)物位于以上的克隆片段內(nèi),也是由北京優(yōu)博基因科技有限公司合成。

1.2 總RNA的提取、定量及合成cDNA

1.2.1 總 RNA的提取、定量

將1.6 mL Trizol提前加到2 mL進(jìn)口離心管中,4℃存放1～2 h;用研缽研磨組織樣至粉狀,然后轉(zhuǎn)移至裝有T rizol的離心管中,使勁震蕩使溶液混勻;在裝有裂解物的離心管中加入0.32 mL的氯仿,用力振蕩混勻,4℃離心17 800 g,16 min;將上清液轉(zhuǎn)移到已加入等體積的異丙醇離心管中,輕輕顛倒混勻,室溫靜置10 min,4℃離心17 800 g,12 min;棄上清液,在 RNA離心管中加入 1 mL75%乙醇,振蕩清洗,4℃離心8 000 g,5 min;小心吸棄上清液,干燥5 min;加入適量DEPC水使RNA沉淀溶解,存放于-70℃。用微量核酸測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度。

1.2.2 cDNA的合成

反轉(zhuǎn)錄在25 μ L體系中進(jìn)行,首先按 RNA濃度計(jì)算不同編號(hào)的RNA需要的總RNA的體積,按計(jì)算值依次添加2 μ g總 RNA,加入 OligodT 2 μ L,置 70 ℃水浴 5 min;然后依次加入 M-MLV RT 5 ×Buffer 5 μ L,10 mmol? L-1dNTPs 5 μ L,200 U ?μ L-1M-MLV 1 μ L,RNA 抑制酶 0.625 μ L,用DEPC處理的ddH2O補(bǔ)至25 μ L。反應(yīng)程序?yàn)?7℃2 h,95℃5 min,產(chǎn)物置-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

1.3.1 PepT1基因部分片段的擴(kuò)增

PCR反應(yīng)體系為 80 μ L:8 μ L10 ×Buffer,2.5 mmol? L-1dNTP 6.4 μ L,5 μ mol?L-1克隆引物上游和下游各 8 μ L,rTaq酶 1.6 μ L,cDNA 模板4 μ L,ddH2O 44 μ L(Takara Taq,10 ×PCR Buffer,dNTP Mixture購(gòu)自Takara公司)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性→94℃1 min→60℃30 s→72℃1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸8 min,反應(yīng)結(jié)束后,將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.3.2 連接轉(zhuǎn)化

按照DNA回收試劑盒的操作說(shuō)明對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、回收。將純化產(chǎn)物與PMD18載體連接,連接體系為 10 μ L,其反應(yīng)組分為:PMD18 載體1 μ L,純化后的 DNA 4 μ L,SolutionⅠ5 μ L,將連接體系置于4℃冰箱中過(guò)夜后加入到200 μ L感受態(tài)大腸桿菌DH5α中(PMD18載體,感受態(tài)細(xì)胞 DH5α均購(gòu)自Takara公司),冰浴30 min后42℃熱擊90 s,冰浴5 min,加入無(wú)氨芐青霉素的 LB液體培養(yǎng)基800 μ L,37℃搖菌1 h,取200 μ L菌液均勻涂于LB培養(yǎng)基上,過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落白斑,放入50 mL LB液體培養(yǎng)基37℃、200 r?min-1振蕩過(guò)夜培養(yǎng)。

1.3.3 提取質(zhì)粒

取出40 mL菌液,分別放入8個(gè)5 mL的離心管中,按照E.Z.N.A.TM Plasmid Mini KitⅠ試劑盒的使用說(shuō)明,在室溫離心1 min,10 000 g,棄上清,加入250 μ L試劑盒所配備的溶液solutionⅠ ,混勻;再加入 250μ L solution Ⅱ,混勻;最后加入350 μ L solutionⅢ混勻,則出現(xiàn)白色絮狀物。再在室溫下離心10 min,13 000 g,用移液槍把液體移到制備管里,放入2 mL的收集管中,在室溫下離心1 min,10 000 g。把廢液棄去,重新用2 mL收集管,加入 500 μ LBufferHB,清洗制備管 ,在室溫下離心1 min,10 000 g,這步是確保蛋白質(zhì)能去掉。把廢液棄去,加入700 μ L DNA Wash Buffer,加之前要確保Wash Buffer加入乙醇(若沒加乙醇則會(huì)溶解DNA),在室溫下離心1 min,10 000 g,把廢液棄去,室溫下離心2 min,13 000 g,干燥。把制備管放在一個(gè)干凈的1.5 mL離心管中,加入60 μ L ddH2O,室溫下放置 2 min,離心 1 min,13 000 g。使其DNA溶解。

1.3.4 測(cè)濃度計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)

由于我們所使用的是小量質(zhì)粒提取試劑盒,提出來(lái)質(zhì)粒的濃度比較低,但我們需要高濃度的質(zhì)粒,所以我們要將溶液濃縮。首先用移液槍把8個(gè)離心管的質(zhì)?；斓揭粋€(gè)離心管里,放到真空泵上,打開真空泵,使得水分蒸發(fā),溶液濃縮,直到溶液濃縮到60 μ L。測(cè)其濃度為254.9 mg?L-1.按以下公式計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù):質(zhì)?？截悢?shù)(copies?μ L-1)=6.02×1023(copies?mol-1)×質(zhì)粒濃度(g?μ L-1)/質(zhì)粒分子量(g?mol-1),則得出質(zhì)粒拷貝數(shù)為1.67×1011。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒用ddH2O進(jìn)行10倍系列稀釋,分別稀釋成1×1010～1×105copies?μ L-1的6個(gè)梯度,作為模板(稀釋的時(shí)候用移液槍吹打30次,振蕩10 s,然后離心,使得溶液充分混勻),進(jìn)行熒光定量PCR來(lái)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。25 μ L熒光定量PCR體系:模板 1μ L,熒光定量 PCR 上、下游引物各0.5 μ L,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μ L,ddH2O 10.5 μ L。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃3 min;95℃10 s→60℃30 s→72℃30 s,40個(gè)循環(huán);72℃5 min;生成溶解曲線步驟:55℃30 s,每30 s升溫0.5℃,81個(gè)循環(huán)。根據(jù)熒光值的變化規(guī)律,系統(tǒng)將自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線。

1.4 熒光絕對(duì)定量PCR測(cè)定PepT1基因的表達(dá)

依照1.3.5中體系將所得cDNA進(jìn)行熒光定量PCR,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出出雛當(dāng)天小雞的cDNA的起始拷貝數(shù)。取出出雛當(dāng)天小雞的cDNA樣品中的1個(gè)樣做兩個(gè)重復(fù),進(jìn)行熒光定量PCR,各加入底物 1 μ L,上、下游引物各 0.5 μ L,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μ L,ddH2O 10.5 μ L 。 通過(guò)PCR反應(yīng)程序,系統(tǒng)將自動(dòng)生成結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 克隆和定量片段PCR擴(kuò)增

用克隆引物進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后,將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳觀察(圖1)。結(jié)果均擴(kuò)增出大小為282 bp的特異性片段,與預(yù)期大小一致。

圖1 PCR電泳圖Fig.1 Electropherogram of PCR product

2.2 絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

通過(guò)Real-time PCR儀擴(kuò)增,自動(dòng)檢測(cè)PepT1基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線(圖2,圖3)。

圖2 雞PepT1基因Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The Standard curve of Real-time PCR of PepT1 gene of chicken

圖2得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=-3.205X+34.170(Y:Ct值,X:起始模板量)。曲線回歸系數(shù)R2=0.990,這說(shuō)明在標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒稀釋質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。曲線的擴(kuò)增效率為E=105.1%。

圖3 雞PepT1基因擴(kuò)增的溶解曲線圖Fig.3 The melting curve of PepT1 gene of chicken amplification product

圖3溶解曲線表現(xiàn)為單一的峰值,產(chǎn)物的Tm值均一,說(shuō)明引物具有很好的特異性。

以上結(jié)果顯示本研究建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線能夠準(zhǔn)確地反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增。

2.3 熒光絕對(duì)定量PCR測(cè)定PepT1基因的表達(dá)

表1為出雛當(dāng)天小雞的cDNA樣品中PepT1基因表達(dá)的起始拷貝數(shù)。

表1 出雛當(dāng)天小雞的PepT1基因表達(dá)的起始拷貝數(shù)Table 1 Starting quantity of PepT1 expression in Chicken at day of hatch

結(jié)果得出未知樣品113中PepT1基因表達(dá)的起始拷貝數(shù)為7.16×105。這表明 1 μ L cDNA 樣品中經(jīng)熒光定量PCR方法檢測(cè)到PepT1基因的mRNA的絕對(duì)數(shù)量為7.16×105個(gè)。在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中,我們?cè)?5 uL反應(yīng)體系中用到的總RNA為2 μ g,因此可得出每 μ L cDNA 樣品是由 0.08 μ g總RNA反轉(zhuǎn)錄得到。最終我們可以算出PepT1基因在小腸細(xì)胞每μ g總RNA中的絕對(duì)表達(dá)量為7.16×105/0.08=8.95×106拷貝。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)首先將雞小腸PepT1的部分克隆片段插入質(zhì)粒載體,將質(zhì)粒作一系列等體積的倍比稀釋,來(lái)作為PCR反應(yīng)的底物,經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng),最后檢測(cè)出來(lái)用作標(biāo)準(zhǔn)來(lái)測(cè)定未知樣品。檢驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有高的特異性和準(zhǔn)確性,同時(shí)具有高敏感性,能夠用于雞小腸PepT1mRNA的定量分析。

迄今為止,小肽在體內(nèi)的代謝、利用機(jī)制,以及日糧中究竟有多少氮以小肽的形式被吸收尚不清楚;參與小肽吸收利用的調(diào)節(jié)因素,包括消化道激素、生長(zhǎng)激素和體內(nèi)有關(guān)代謝產(chǎn)物等,以及在不同動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中,日糧蛋白質(zhì)的種類和數(shù)量、體內(nèi)激素和有關(guān)代謝產(chǎn)物對(duì)PepT1基因表達(dá)的調(diào)控作用,都有待于深入研究[10]。如何利用在消化過(guò)程產(chǎn)生的肽種類、數(shù)量、比例,以及小肽不同于游離氨基酸吸收利用的特點(diǎn)對(duì)飼料中的可利用氨基酸進(jìn)行重新評(píng)定,也需深入研究。在進(jìn)行雞的分子生物學(xué)研究時(shí),Real-time PCR是作為有力的工具之一,本試驗(yàn)建立的雞PepT1基因的絕對(duì)熒光定量方法,具有檢測(cè)范圍廣(Ct值范圍從2～18),特異性強(qiáng)(熔解線分析顯示產(chǎn)物特異的單個(gè)峰)的特點(diǎn),將為測(cè)定雞小腸PepT1基因在小腸中的絕對(duì)表達(dá)提供基礎(chǔ)。

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