星豹蛛乙酰膽堿酯酶活性測定條件的優(yōu)化

馬敏,張賓,李生才

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,山西 太谷030801;2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 文理學(xué)院,山西太谷 030801)

星豹蛛(Pardosaastrigera L.Koch)是我國森林、草地、農(nóng)田捕食性天敵的優(yōu)勢種之一。近年來,隨著農(nóng)藥的大量使用,在殺死目標(biāo)害蟲的同時對天敵非靶標(biāo)生物也造成了傷害。國內(nèi)外有關(guān)農(nóng)藥對蜘蛛等天敵的殺傷力的研究已有大量報道[1～3],而國內(nèi)起步較晚,近幾年的研究主要集中在農(nóng)藥對捕食性天敵殺傷力及其捕食功能及行為的影響,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)農(nóng)藥對蜘蛛均有很高的毒性作用,且降低了蛛體的控蟲能力[4,5]。

農(nóng)藥在短期內(nèi)還無法完全停止使用,對天敵的副作用仍將存在,如何更有效地保護星豹蛛種群成為當(dāng)前亟待解決的問題之一。乙酰膽堿酯酶(AChE)是大多數(shù)農(nóng)藥,尤其是有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑的作用靶標(biāo)酶。AChE的測定方法雖然已很成熟,但不同來源的AChE最適測定條件會有所不同,對星豹蛛的AChE還沒有詳細(xì)的研究。為了系統(tǒng)研究星豹蛛AChE的特性,保護節(jié)肢動物,為今后對其性質(zhì)進行系統(tǒng)全面的探索,特開展了本項研究。

1 材料與方法

1.1 供試動物來源

星豹蛛成蛛采自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)未噴施農(nóng)藥的雜草地,活體帶回實驗室禁食48 h后備用。

1.2 主要儀器與試劑

D-37520型高速冷凍離心機,Sigma公司產(chǎn)品、VERS Amax型酶標(biāo)儀、Sartorius BS型電子天平、水浴鍋。

T riton X-100,北京生物科技有限公司產(chǎn)品;碘化硫代乙酰膽堿(acetylthiocholine iodide,ATCh),Sigma公司產(chǎn)品;考馬斯亮藍(lán)G-250,Fluka公司產(chǎn)品;5,5'-二硫雙硝基苯甲酸(5,5'-dithiobis-2-nitrobenzoic acid,DTNB);KH2PO4及Na2HPO4均為國產(chǎn)分析純。

1.3 酶液制備

按表1中各項酶液濃度將新鮮星豹蛛頭胸部置于勻漿器中,用不同pH值0.1 mol?L-1磷酸緩沖液(含0.1%Triton X-100)作為提取液,在冰水浴中充分勻漿。勻漿液于4℃,15 000×g,離心20 min。取上清液作為酶源。

1.4 蛋白質(zhì)含量測定

參照Bradford(1976)考馬斯亮藍(lán)G-250法[6]。

1.5 試驗方法

參與星豹蛛AChE反應(yīng)的5個因素列于表1。

表1 影響星豹蛛Ache反應(yīng)的因素及水平Table 1 Effect of factors and their levels for acetylcholinesterase from the Cephalothorax of Pardosa astrigera

1.6 星豹蛛頭胸部乙酰膽堿酯酶活性測定

由DPS系統(tǒng)得到 25個組合,如表 2所示,進行各組酶活性測定。取待測酶液 0.02 mL,與0.02 mL不同濃度的ATCh混勻,置于水浴鍋中反應(yīng)相應(yīng)的時間,取出后加入 0.18 mL顯色劑(DTNB)終止反應(yīng),置于酶標(biāo)板上在412 nm測定光密度(OD)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 星豹蛛頭胸部AChE酶活性的測定

測得的25組星豹蛛頭胸部AChE的酶活性值見表2。

表2 星豹蛛頭胸部AChE不同處理組合測定的酶活性值Table 2 Application of L25(56)orthogonal experiment in assaying the AChE activity from cephalothorax of P.astrigera

2.2 星豹蛛頭胸部AChE正交試驗結(jié)果的極差分析

極差分析是正交試驗結(jié)果直觀分析的主要依據(jù)。星豹蛛頭腦部AChE正交試驗結(jié)果極差數(shù)據(jù)見表3。

表3 L25(56)的正交試驗極差表Table 3 Analysis of the results from orthogonal projects with the methods of range analysis

根據(jù)表3中各因素的極差值R大小可以判斷各因素對星豹蛛AChE酶活性影響的程度。其先后順序依次為:pH值＞反應(yīng)時間＞酶濃度＞溫度＞底物濃度。其中pH值的極差最大,表明pH值是測定星豹蛛頭胸部AChE酶活性時的關(guān)鍵性因子,影響最大,試驗操作時應(yīng)注意加以控制。

應(yīng)用極差分析的結(jié)果,得到5因素對星豹蛛AChE酶活性最優(yōu)條件的直觀分析圖(圖1～圖5)。

由圖1可以看出,在試驗設(shè)定的酶液濃度范圍內(nèi),隨著酶液的濃度的增大,AChE酶活性下降,說明酶液濃度越高會對酶活力產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)酶濃度為12 g?L-1時,AChE酶活性最大。

圖1 酶液濃度對酶活性的影響Fig.1 The effect of concentration on AChE activity

由圖2可見,隨著底物濃度的增加,星豹蛛頭部AChE酶活性逐漸減小,說明過量的底物會對酶的活性產(chǎn)生抑制作用。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.6 mmol?L-1時,星豹蛛頭胸部AChE酶活性達(dá)到最大值。

圖2 底物濃度對酶活性的影響Fig.2 Effect of concentration of substrate on enzyme activity

pH過小(過酸)、過大(過堿)都能使酶蛋白變性而失活,且pH值的改變會影響酶活性中心的必須基團的解離程度,只有在特定的pH值范圍內(nèi),才使酶的反應(yīng)速度達(dá)到最大值。如果pH高于8.0,起終止反應(yīng)的試劑DTNB就會發(fā)生自發(fā)水解[7]。由圖3可見,在試驗設(shè)置的體系pH值范圍內(nèi),當(dāng)pH達(dá)到7.0時,酶活達(dá)最大值。

圖3 pH值對酶活性的影響Fig.3 Effect of pH values on enzyme activity

由圖4看出,隨著溫度的升高,星豹蛛頭胸部AChE酶活性逐漸升高,在30℃時達(dá)到最大值,隨后逐漸降低。

圖4 溫度對酶活性的影響Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity

由圖5可以看出,水浴時間過長對酶活性會產(chǎn)生抑制作用,水浴5 min后酶活性達(dá)到最大值。

圖5 反應(yīng)時間對酶活性的影響Fig.5 Effect of time on enzyme activity

2.3 正交試驗結(jié)果的方差分析及多重比較

由于經(jīng)F檢驗5個因素均達(dá)到極顯著水平,故采用Duncan(新復(fù)極差法)法進行因素各水平的差異顯著性檢驗,以便從中選出測定星豹蛛頭胸部AChE酶活性的最適條件組合。結(jié)果見表4。由表4可以看出,五個因素的影響順序與極差分析的結(jié)果相一致,5個因素對測定星豹蛛頭胸部AChE的酶活性均有影響,在測定時都要加以控制。

表4 正交試驗的5個影響因素各水平的差異顯著性檢驗(SSR檢驗)Table 4 Multiple comparison in five factors with the method of Duncan(SSR test)

3 結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明,在影響星豹蛛頭胸部AChE酶活性測定的5個因素中,pH值對測定星豹蛛AChE酶活性的影響最大,因此要在具體的試驗中加以控制。同時,測定AChE酶活性(Ellman法)需限制在一定的pH值范圍內(nèi)。在堿性條件下,大多數(shù)有機磷和氨基甲酸酯類殺蟲劑易分解,所以使用的緩沖液的 pH值不宜過高,以 7.0～7.6為宜[8]。溫度對酶活性的影響很大,既能使酶反應(yīng)速度加快,也能使酶變性而影響酶促反應(yīng)速度。不同的酶或不同來源的同一種酶,其反應(yīng)的最適溫度可能是不同的,如哺乳動物的AChE最適溫度通常在37℃,鳥類42℃,昆蟲中家蠅是30℃[9]。本試驗酶液濃度和底物濃度對酶活性的影響均是由高到底的變化趨勢,說明以一頭星豹蛛為研究對象時,此條件下酶活性最大,且易于試驗操作。但是對于測定同屬于狼蛛科的擬環(huán)紋豹蛛AChE活性時所用的底物濃度0.8 mmol?L-1[10]對星豹蛛不適用。為了更加準(zhǔn)確迅速測定酶的酶活性,有必要確定最適反應(yīng)時間。通過正交試驗確定了測定星豹蛛頭胸部AChE活性是的最佳組合條件:酶濃度12 g?L-1;底物濃度為0.6 mmol?L-1;反應(yīng)體系pH值為7.0;反應(yīng)溫度為30℃;反應(yīng)時間為5 min。

通過本試驗可以看出,正交試驗作為多因素分析的一種設(shè)計,可以通過部分實施了解全面試驗情況,從中找出較優(yōu)的處理組合,大大節(jié)省人、財、物力和時間,使一些難以實施的多因素實驗得到實施,此方法可以很好地簡化試驗[11]。本試驗選用的星豹蛛是北方夏季的成蛛,這個時期是農(nóng)田施藥的高峰期,研究這時期的星豹蛛,可以更好的為保護它提供有利的理論依據(jù)。同一生物不同時期AChE分子大小、形狀、溶解性等理化性質(zhì)存在差別[12]。有些昆蟲AChE活性隨著齡期增加而增加[12],有些昆蟲AChE活性隨著齡期增加而減弱[13]。而對于星豹蛛體內(nèi)AChE的活性的最適反應(yīng)條件是否會隨季節(jié)、晝夜節(jié)律及齡期的不同而變化,仍有待于進一步研究。

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