細(xì)菌人工染色體基因組文庫的構(gòu)建及應(yīng)用

任斐

（河南科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003）

DNA克隆技術(shù)是分子生物學(xué)研究中重要的技術(shù)手段之一，特別是大片段DNA克隆是復(fù)雜基因組分析中的第一步.而用于克隆DNA片段的載體系統(tǒng)則一直是分子生物學(xué)中的重要工具.1983年，Murry[1]把酵母染色體的著絲點(diǎn)、自主復(fù)制序列和端粒子連接在一起，構(gòu)建成了第一個人工染色體，稱為酵母人工染色體（Yeast Artificial Chromosome，YAC）.在此基礎(chǔ)上，Burke[2]構(gòu)建了第一個 YAC 載體，并以此來克隆人基因組中的大片段DNA分子，它可插入上千kb左右的外源DNA.YAC的插入片段比噬菌體、cosmid載體在細(xì)菌宿主中的插入片段至少達(dá)十倍以上，能夠覆蓋完整的基因組，但是其自身有難以克服的缺點(diǎn)：存在嵌合現(xiàn)象，克隆的穩(wěn)定性差，插入片段存在重排和丟失現(xiàn)象，插入片段的分離和純化困難，轉(zhuǎn)化效率低[3].因此，一種大容量、并能獨(dú)立穩(wěn)定存在和遺傳的人工染色體顯得尤為重要.

1 細(xì)菌人工染色體載體的優(yōu)點(diǎn)

細(xì)菌人工染色體（Bacterial Artificial Chromosome，BAC）的構(gòu)建基礎(chǔ)是大腸桿菌（E.Coli）的F因子，其至少應(yīng)具備三種功能元件的類似組份：復(fù)制原點(diǎn)（origin of replication），著絲點(diǎn)（centromere）和端粒（telomere）.BAC相對YAC而言，具有很多優(yōu)勢：①通過電擊方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌比YAC轉(zhuǎn)化酵母的轉(zhuǎn)化率提高了10～100倍，降低了文庫構(gòu)建所需的DNA量，尤其適合于目的DNA資源有限的文庫構(gòu)建；② 雜交篩選文庫對于細(xì)胞中存在的單拷貝BAC載體都是可行的；③YAC以線形分子存在，BAC載體則以環(huán)形超螺旋狀態(tài)存在，使得后者在分離操作上相對容易，使用常規(guī)的堿裂解方法即可做到；④BAC載體在大腸桿菌宿主中穩(wěn)定復(fù)制，一般保持低拷貝，減少了所攜帶DNA片段的重組，使外源DNA片段保持穩(wěn)定；⑤YAC克隆中普遍存在20%～40%的嵌合現(xiàn)象是YAC文庫的最大缺陷，這主要是自由連接和同源重組形成的，而BAC克隆由于大腸桿菌重組缺陷型菌株的獲得和大腸桿菌只允許一個細(xì)胞接受一個外源DNA分子，幾乎不存在嵌合現(xiàn)象.

2 細(xì)菌人工染色體文庫的構(gòu)建及鑒定

基因組文庫是用重組DNA技術(shù)將某種生物細(xì)胞的核基因組DNA的全部片段隨機(jī)地連接到克隆載體上，再轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中，通過細(xì)胞增殖而形成的各個片段的無性繁殖系的總集.通?；蚪M文庫所包含的克隆數(shù)目多到可以覆蓋某種生物基因組的數(shù)倍.BAC文庫構(gòu)建主要有以下幾個步驟.

2.1 BAC載體的制備

BAC載體的好壞直接關(guān)系到文庫中空白載體的比例和文庫的質(zhì)量.載體DNA的提取采取堿裂解法，用氯化銫—溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)載體DNA[4].用限制性內(nèi)切酶對載體DNA進(jìn)行酶切消化，為減少空白載體的比例還應(yīng)用脫磷酶對載體進(jìn)行充分的脫磷處理[5]，再用連接酶對脫磷后的載體DNA進(jìn)行自連，最后回收完全脫磷的線性化載體.

2.2 高分子量核DNA的制備

一般是在液氮中將樣品組織研磨成粉末，在整個研磨過程中均使組織浸在液氮中[6]；也可以是從血液中提取白細(xì)胞[7].為防止核DNA降解，一般采用2種低熔點(diǎn)瓊脂糖包埋核DNA的方法，一是將核DNA包埋在低熔點(diǎn)瓊脂糖中形成栓塞（plugs），二是將核DNA包埋在低熔點(diǎn)瓊脂糖和礦物油混合物中形成微粒（microbead）.前者在制備方法、對核DNA的保護(hù)作用和操作上明顯優(yōu)于后者.之后對核DNA進(jìn)行酶切，一般通過兩次脈沖場電泳進(jìn)行片段選擇以獲得大小比較集中的片段[8].凝膠中回收DNA片段有兩種方法：瓊脂糖酶消化和電洗脫.采用電洗脫得到的DNA比用β-瓊脂糖酶I處理得到的更完整，對DNA分子粘性末端破壞程度小于瓊脂糖酶消化方法，有效提高連接效率和插入片段的大小.但是電洗脫方法更加耗時，回收過程中DNA的損失也較多.

2.3 大片段核DNA與載體連接

大片段核DNA能否有效地連接到載體上主要取決于插入DNA片段與載體的比例，對于不同生物采用的比例不同，大多數(shù)BAC文庫采用1∶5～1∶15摩爾比[9].連接之后將連接產(chǎn)物在ddH2O上透析脫鹽可以去除其中的高鹽成分，避免電擊轉(zhuǎn)化過程中的電擊穿現(xiàn)象.然后在含PEG 8000的0.5×TE上透析濃縮處理，可以提高轉(zhuǎn)化效率數(shù)倍.但是透析之后的連接產(chǎn)物應(yīng)立刻進(jìn)行轉(zhuǎn)化，因?yàn)楸绕鹜肝鲋埃肝龊蟮倪B接產(chǎn)物更容易降解和積聚.

2.4 重組載體轉(zhuǎn)化受體感受態(tài)細(xì)胞

對于轉(zhuǎn)化大腸桿菌而言，電轉(zhuǎn)化是目前使用最普遍的一種方法.電轉(zhuǎn)化效率與插入片段的大小有關(guān)，插入片段越大，轉(zhuǎn)化效率越低.此外，轉(zhuǎn)化條件也直接影響轉(zhuǎn)化效率、插入片段大小及假陽性克隆的含量.因此，在大規(guī)模轉(zhuǎn)化前需進(jìn)行轉(zhuǎn)化預(yù)試驗(yàn)，以選擇最佳的轉(zhuǎn)化條件.

2.5 挑取陽性克隆構(gòu)建文庫

可通過lac Z的α互補(bǔ)所形成的藍(lán)白菌落篩選陽性克隆，陽性克隆的分檢有人工和全自動分子生物學(xué)工作臺技術(shù)兩種.

陽性克隆可以接種至無菌的含有氯霉素LB培養(yǎng)基的384孔板中，37℃培養(yǎng)16 h后，用帶有384個塑料針頭的復(fù)制器復(fù)制接種可以得到復(fù)制板.原板和復(fù)制板文庫可以在-80℃中長期保存.

2.6 BAC文庫的篩選

文庫構(gòu)建完成后，需要對文庫進(jìn)行評價，評價一個BAC文庫質(zhì)量高低的標(biāo)準(zhǔn)是文庫中克隆的數(shù)量、插入片段大小、細(xì)胞器DNA的含量，及假陽性克隆的含量.

用與目的基因緊密連鎖的單拷貝標(biāo)記探針篩選BAC文庫，檢驗(yàn)構(gòu)建的BAC文庫是否具有很好的代表性和實(shí)用性

2.7 BAC克隆的質(zhì)量鑒定

從文庫中隨機(jī)挑取一定量的BAC克隆，用堿裂解法提取BAC DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，用脈沖場凝膠電泳（PFGE）檢查插入外源DNA片段的大小.文庫的平均插入片段大小以及所包含的重組克隆數(shù)決定了從中篩選出某個基因的概率，可以通過Clarke L.和Carbon J.在1975年提出公式計(jì)算：

其中P是從建成的基因文庫中可能選出某一基因的概率.f是該基因文庫中每一克隆所含外源DNA片段的平均長度，可根據(jù)該生物基因組大小和所用載體可容納的外源DNA片段的長度決定.G是該生物基因組的大小，基因組大小和DNA片段長度的單位可用道爾頓或堿基對表示.N是這一基因文庫所應(yīng)包含的克隆數(shù)目.

最高質(zhì)量的BAC文庫是那些插入片段大小為150 kb，覆蓋基因組10倍，非重組克隆少于5%的文庫[10].

2.8 BAC克隆的穩(wěn)定性鑒定

挑選幾個較大的BAC克?。ǚ肿恿糠謩e為140、250 kb），分別接種在培養(yǎng)基上，連續(xù)繼代培養(yǎng)后，分別提取第0代和第100代BAC克隆的質(zhì)粒DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，脈沖電泳檢查BAC克隆中外源DNA在繼代培養(yǎng)中是否存在和發(fā)生突變[6，7].

2.9 檢查BAC文庫是否含有細(xì)胞器DNA的污染

核DNA文庫混雜細(xì)胞器DNA的污染，不僅會降低實(shí)際庫容量，還可能會誤導(dǎo)染色體步移走向錯誤方向[11].采用脈沖電泳純化法制備高純度大分子量DNA，進(jìn)行BAC文庫的構(gòu)建，可以從根本上避免細(xì)胞器DNA的污染.同時以線粒體基因?yàn)樘结樑cBAC克隆進(jìn)行菌落原位雜交，檢驗(yàn)BAC克隆有無細(xì)胞器DNA的污染.

到目前為止，已經(jīng)成功構(gòu)建了很多種BAC文庫.大致可以分為三種類型：第一種是整個核基因組的BAC 文庫，第二種是部分基因組的 BAC 文庫[12]，第三種是構(gòu)建 BAC 池[13].

3 BAC文庫的應(yīng)用

BAC文庫許多對現(xiàn)代生物學(xué)研究都非常有用，比如分離完整的基因或基因簇，構(gòu)建基因組的物理圖譜，研究基因功能結(jié)構(gòu)，定位克隆，長距離DNA測序和錨定，鑒定假設(shè)的順式調(diào)節(jié)元件以及比較基因組學(xué)的研究等.

3.1 重要性狀基因的克隆

對于已知序列的目的基因的篩選，通常采用2種方法：PCR篩選和分子雜交方法.

PCR方法是將各個單克隆混合組成各個混合池，Asakawa S.等提出了兩步-4維（4 D）方法篩選[14].以96孔板為例，每個96孔板混合成1個混合物，然后每100個混合物排列成10×10的矩陣，每行混合成1個混合物，共10個組成1維（1 D），分別是1 D-1…1 D- 10；每列混合成1個，共10個組成2維（2 D），分別是2 D-1…2 D-10.每個96孔板由12×8個孔組成，每100個96孔板同一位置上的孔混合，這樣將100個96孔板壓縮成1個96孔板，然后按照前面的方法分別組成3 D和4 D.1 D～2 D混合或3 D～4 D混合組成1個超級池，含有9 600個克隆.第一步篩選出陽性超級池，第二步篩選1 D～4 D：篩選1 D、2 D可以知道哪塊96孔板含有陽性克隆，篩選3 D、4 D可以知道這100個96孔板中哪個孔含有陽性克隆，二者結(jié)合就可以得知陽性克隆的具體位置.單個超級池中陽性克隆的數(shù)（n）存在的可能性（r）可以通過下面公式計(jì)算得出

其中n＜＜p，q.p是文庫覆蓋基因組一倍所需的克隆數(shù)，q是這個超級池中的克隆數(shù).以Asawaka S.等篩選的人基因組BAC文庫的平均插入片段110 kb，覆蓋基因組一倍需要34 000個克隆，一個超級池含有9 600個克隆，根據(jù)上述公式一個超級池中含有一個陽性克隆的可能性r=0.213，概率為86.6%.這種PCR篩選文庫的方法非常簡便，所需時間很短.

分子雜交分為膜雜交和Southern blot.膜雜交可以是高密度復(fù)制（high-density replica，HDR）膜或低密度膜，是用尼龍膜制作文庫的復(fù)制品，然后用質(zhì)粒、YACs或cDNAs作為探針進(jìn)行HDR膜的菌落雜交（colony hybridization），最后通過自顯影顯示出陽性克隆.Southern blot是將每張HDR膜作為一組，用限制性內(nèi)切酶消化此組的總BACDNA作為一張southern膜上的一條泳道，因此一張southern膜上可以檢測很多張HDR膜.在篩選的開始使用Southern blot可以有效減少菌落雜交所需要的HDR膜的數(shù)量.

3.2 基因的圖位克隆

基因的圖位克隆（map-based cloning）又稱為定位克隆（positional cloning），是用于分離尚不知道編碼產(chǎn)物的目的基因的一種有效的方法.這種方法是根據(jù)目的基因在染色體上的位置進(jìn)行的，基本包括以下環(huán)節(jié)：首先建立目的性狀的分離群體，利用分子標(biāo)記技術(shù)在目的基因兩側(cè)尋找與之緊密連鎖的標(biāo)記，利用遺傳圖譜和物理圖譜將目的基因定位在染色體的特定位置上；其次構(gòu)建大片段基因組文庫（BAC或YAC），用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記為探針篩選文庫，并用獲得的陽性克隆構(gòu)建目的基因區(qū)域的重疊群；找到與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記和鑒定出分子標(biāo)記所在的大片段克隆以后，以該克隆為起點(diǎn)用染色體步移或染色體登陸方法（chromosome landing）逐漸靠近目的基因，以該克隆的末端做為探針篩選基因組文庫，鑒定和分離出鄰近的基因組片段的克隆，再將這個克隆的遠(yuǎn)端末端做為探針重新篩選基因組文庫，繼續(xù)這一過程，直到獲得具有目的基因兩側(cè)分子標(biāo)記的大片段克隆或重疊群[15]，隨后通過壓克隆獲得含有目的基因的小片段克隆，最后通過遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)證實(shí)目的基因的功能.由此可以看出，基因圖位克隆成功實(shí)施的關(guān)鍵因素之一是構(gòu)建大片段基因組文庫并篩選陽性克隆.BAC載體已在許多基因的圖位克隆中做出了貢獻(xiàn).Song[16]等構(gòu)建了水稻的BAC文庫，并通過圖位克隆獲得了Xa21抗病基因.

3.3 基因組物理圖譜的構(gòu)建

BAC載體具有插入片段大、易分離等特點(diǎn)，在物理圖譜的構(gòu)建中發(fā)揮了重要作用.物理圖譜所容納的信息不僅包括基因的編碼區(qū)也包括了內(nèi)含子及基因的調(diào)控區(qū).基因組物理圖譜不僅是基因組測序的底物和基因圖位克隆的橋梁，而且對研究基因的結(jié)構(gòu)、功能、時空表達(dá)以及基因間的關(guān)系研究都極為重要.一些模式生物的全基因組物理圖譜一旦得以構(gòu)建，即可通過基因組序列分析找到大量的功能基因，還能發(fā)展新的分子標(biāo)記以增強(qiáng)遺傳圖譜上分子標(biāo)記的密度，加速基因圖位克隆的進(jìn)程.

3.4 基因組測序

基因組測序是發(fā)現(xiàn)、克隆、解碼大范圍基因的有力工具，是確定包括功能未知基因在內(nèi)所有基因的完整序列和內(nèi)、外顯子結(jié)構(gòu)所必需的.BAC文庫性質(zhì)穩(wěn)定，保真度高，并且對普通的自動化DNA制備純化程序相容，所以成為基因組分析中優(yōu)先選擇的克隆系統(tǒng).BACs既可以通過亞克隆到質(zhì)粒上進(jìn)行測序，也可以直接作為原始底物進(jìn)行末端測序及內(nèi)部核苷酸分析.

3.5 在比較基因組學(xué)中的應(yīng)用

比較基因組學(xué)（comparative genomics）是對來自不同的物種的已知基因和基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較，以了解基因的功能、表達(dá)機(jī)理和物種進(jìn)化.比較基因組學(xué)研究的主要方法有生物信息學(xué)、DNA微陣列和BAC陣列（BAC arrays）3種，這些方法均與BAC有關(guān).DNA測序量的突飛猛進(jìn)改變了生物學(xué)研究方法.使得研究者可以不再依賴于“通過實(shí)驗(yàn)”來推斷基因組在漫長的進(jìn)化過程中是如何分化的.研究者可以直接觀察基因組的變化，更清楚地了解基因組的組成和調(diào)節(jié)方式，了解是哪些變化造就了新物種.作為分析非編碼順式調(diào)控區(qū)是如何對基因組功能起作用的第一步，“targeted comparative sequencing”策略是對來自不同物種的直系同源的基因組區(qū)域的BACs進(jìn)行測序.最終目的是得到不同基因組垂直同源區(qū)的序列信息并進(jìn)行比對，可以推斷出基因的非編碼順式調(diào)控元件的保守性.

4 結(jié)語

從第一個BAC載體構(gòu)建至今，BAC由于其自身的一些優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因和基因組研究，諸如基因組文庫的構(gòu)建、基因的圖位克隆、基因組物理圖譜的構(gòu)建、基因組測序、基因的組織結(jié)構(gòu)分析以及基因表達(dá)調(diào)控和基因轉(zhuǎn)化等研究.BAC文庫是克隆進(jìn)BAC載體的大量外源基因插入片段的集合，并在大腸桿菌中復(fù)制.這些文庫在各類生物的基因組計(jì)劃中發(fā)揮了重要作用.隨著更加完美的BAC載體的發(fā)展以及更多生物BAC文庫的構(gòu)建完成，必將對基因組研究產(chǎn)生巨大的影響.

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