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    CD80聯(lián)合CD28/CpG ODN活化的PBMC對胃癌細(xì)胞殺傷作用的實(shí)驗(yàn)研究

    2010-04-24 10:53:20郭樹軍李永研
    實(shí)用醫(yī)藥雜志 2010年3期
    關(guān)鍵詞:靶細(xì)胞細(xì)胞株活化

    方 軍,郭樹軍,李永研

    利用外周血單個核細(xì)胞(PBMC)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用是腫瘤治療中近年研究較為廣泛的一種方案。本文旨在對體外聯(lián)合應(yīng)用CD80和CD28/CpGODN共刺激活化PBMC在體外對胃癌細(xì)胞的影響及殺傷途徑作出初步研究。

    1 材料與方法

    1.1 材料 健康人外周血由153中心醫(yī)院血站提供,胃癌細(xì)胞株MKN45由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院消化內(nèi)科提供,RPMI1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品,新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品,胰蛋白酶為Sigma公司產(chǎn)品。單克隆抗體CD28干粉CD80、T細(xì)胞亞群、干粉均購自Immunotech公司,蒸餾水溶解至所需濃度,分裝,-30℃保存。CpG ODN由上海生工生物工程公司合成,其序列為5'GGGGTC AACGTIGAGGGGGG 3',重組人IL-2為北京四環(huán)生物工程制品廠產(chǎn)品,淋巴細(xì)胞分離液為TBD生物技術(shù)研究所產(chǎn)品,噻唑藍(lán) (Mar)及二甲基亞砜(DMSO)為Amresco公司產(chǎn)品。

    1.2 方法

    1.2.1 外周血PBMC的分離與體外培養(yǎng) 100 ml血用 Ficoll密度梯度離心分離單核細(xì)胞,用RPMI1640培養(yǎng)(含100 ml/L滅活小牛血清),每管10 ml,分別加入維持量IL-2(20 kU/L),CD28(0.4 mg/L),CD80(0.4 mg/L)在37℃、50 ml/L CO2孵箱中培養(yǎng)1、2、3、4、5 d共5個時間段。

    1.2.2 胃癌細(xì)胞株MKN45培養(yǎng) 用1~2 ml 0.25%胰蛋白酶消化2~3 min,傾出胰酶,用約2 ml RPMI 1640液輕洗1次,傾出,加2 ml 1640液吹散細(xì)胞,再加入含10%小牛血清的RPMI1640液,共10 m l。在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),直至形成單層細(xì)胞,傾出培養(yǎng)液,加入抗體誘導(dǎo)的不同時間段的PBMC培養(yǎng)1 d。對照組不作用胃癌細(xì)胞,收獲細(xì)胞,-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 體外淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn) 以上法在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞,將腫瘤細(xì)胞用胰酶消化,調(diào)細(xì)胞至不同濃度,依次分為4組:實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2將活化的PBMC與腫瘤細(xì)胞(效靶細(xì)胞)按20∶1接種至96孔板,效、靶體積均為100 μl組2加1×108mmol/L CI-988;實(shí)驗(yàn)組3用CD80(0.4 mg/L)的100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng);對照組用100 ml/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。每天胰酶消化法計(jì)數(shù)每組4孔,繪制細(xì)胞在不同條件下的生長曲線,共同培養(yǎng)24 h,終止培養(yǎng)前加入MTT10 μl(5 mg/ml),37℃含5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,棄上清液,加入DMSO 150 ml,充分溶解,570 nm波長酶標(biāo)儀檢測OD值。殺傷率=[1-(實(shí)驗(yàn)孔OD值-效應(yīng)孔OD值)/靶細(xì)胞孔OD值]×100%。

    1.2.4 電鏡觀察 將PBMC作用不同時間腫瘤細(xì)胞,用PBS清洗,加固定液,邊固定邊吹打,使細(xì)胞與固定液充分混勻,30min后,300r/min離心10min,棄上清,加固定液混勻過夜,離心半徑8 cm 3 000 r/min離心15 min收集細(xì)胞。

    1.2.5 懸浮生長細(xì)胞的凋亡檢測 活化的PBMC和CD80(0.4 mg/L)和腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)72 h后,用橡皮刮收集懸浮生長的細(xì)胞,800~1 000 r/min離心5 min,棄上清液,加入預(yù)冷的1X結(jié)合緩沖液100 μl重懸細(xì)胞,置冰浴。加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI于細(xì)胞懸液中輕輕混勻。將試管置于4℃避光染色10 min。補(bǔ)加490 μl結(jié)合緩沖液混懸細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 在SPLM軟件中輸入實(shí)驗(yàn)中各測定值,采用未配對計(jì)量資料的t檢驗(yàn)及χ2檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

    2 結(jié) 果

    2.1 細(xì)胞殺傷作用 活化的外周血PBMC對腫瘤細(xì)胞均有較強(qiáng)的殺傷作用,效應(yīng)細(xì)胞,靶細(xì)胞之比需要達(dá)到20∶1,才能達(dá)到半數(shù)殺傷率。CD80與CD28/CpG ODN活化的PBMC合用,對胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞的殺傷作用顯著大于CD80本身對胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞殺傷作用(P<0.01),亦大于單獨(dú)應(yīng)用CD28/CpG ODN活化PBMC對胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞的殺傷作用(P<0.05),且靶細(xì)胞只達(dá)到15∶1就能達(dá)到半數(shù)殺傷率。主要指標(biāo)見表1、圖1。

    表1 不同處理對胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞的殺傷率(n=3,±s,%)

    表1 不同處理對胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞的殺傷率(n=3,±s,%)

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    圖1 細(xì)胞生長曲線

    2.2 電鏡結(jié)果 共刺激細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)12 h后可見,大部分細(xì)胞已經(jīng)死亡,兼有壞死及凋亡細(xì)胞。早期凋亡細(xì)胞胞漿濃縮,核濃縮,染色質(zhì)邊集,形成花環(huán)狀;出現(xiàn)較多的凋亡小體(圖2),小體有完整的膜包裹,異染色質(zhì)邊集,可見電子密度致密的核碎片,膜內(nèi)可見細(xì)胞器及脂質(zhì)空泡;同時見活化的T細(xì)胞有較多的微絨毛、細(xì)胞體積大,胞漿變得較為豐富,核大,電子密度低,核仁明顯。

    圖2 早期凋亡細(xì)胞電鏡圖(醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙染色6 000×)

    2.3 流式細(xì)胞儀結(jié)果 流式細(xì)胞儀FCM圖像可見實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞群壞死細(xì)胞占 31.2%,凋亡細(xì)胞占22.1%。而對照組僅有壞死細(xì)胞0.1%,凋亡細(xì)胞1.7%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,有非常顯著性差異(P<0.01)。

    3 討 論

    T細(xì)胞受體(TCR)是參與特異性免疫的重要分子,在T淋巴細(xì)胞活化過程中識別和結(jié)合配體。研究發(fā)現(xiàn)正常個體在抗原刺激下,外周血淋巴細(xì)胞(PBLs)TCRVβ基因隨抗原類型不同或疾病的不同臨床階段呈選擇性擴(kuò)增[1]。近年來對于CpG ODN的認(rèn)識越來越深入,其誘生的IL-12、INF-α、TNF對腫瘤細(xì)胞均有抑制殺傷作用,并促使TH0細(xì)胞轉(zhuǎn)化成為Th1細(xì)胞,因此其在腫瘤治療方面亦漸成為熱點(diǎn)[2-4]。國外已有人基于體外容易得到的人外周血單個核細(xì)胞(PBMC),用CD3、CD28抗體在體外擴(kuò)增活化T淋巴細(xì)胞,利用激活表型為CD8+CD25+的殺傷細(xì)胞回輸治療免疫力下降引起的感染與腫瘤發(fā)生作為腫瘤免疫治療的新手段[5]。TCR CD3復(fù)合體接受抗原或相應(yīng)MOAb刺激后,可導(dǎo)致多個與之相關(guān)的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶(PTK)的活化,并通過一些PTK的底物來介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng),調(diào)控核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致T細(xì)胞活化增殖,發(fā)揮效應(yīng)功能。至于不同的效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞比值(簡∶效∶靶細(xì)胞比值)的殺傷效果評價(jià),本文結(jié)果顯示,靶細(xì)胞濃度反應(yīng)比值對不同的腫瘤細(xì)胞均有一定的殺傷作用,要達(dá)到半數(shù)致死量,效∶靶細(xì)胞比值應(yīng)不小于20∶1,但是CD80與CD28/CpG ODN共刺激活化PBMC合用,只要達(dá)到15∶1就能達(dá)到半數(shù)殺傷率。本文結(jié)果還顯示,體外培養(yǎng)6 d,1 mmol/L活化T細(xì)胞和CD80(0.4 mg/L)分別可致胃癌細(xì)胞株MKN45細(xì)胞生長抑制率達(dá)91%和52%,與文獻(xiàn)報(bào)道一致,二者聯(lián)合使用殺傷作用更明顯,于培養(yǎng)3 d和6 d,抑瘤率達(dá)40%和97%。MTT法檢測殺傷率,聯(lián)合應(yīng)用1 mmo1/L活化外周血PBMC和1×10-8mmol/L CI-988較單用任何一種其殺細(xì)胞作用更明顯(P<0.05)。聯(lián)合應(yīng)用二者抑瘤效果較單用任何一種措施更明顯(P<0.05)。透射電鏡下體外培養(yǎng)可見兼有凋亡與壞死征象,這種現(xiàn)象同時也在體外細(xì)胞培養(yǎng)的流式細(xì)胞儀檢測中得到證實(shí)。筆者前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)活化T細(xì)胞引起結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞死亡的過程中有凋亡機(jī)制參與,因此認(rèn)為,CD80可能通過提高結(jié)腸癌細(xì)胞對凋亡刺激的敏感性而與活化T細(xì)胞產(chǎn)生協(xié)同治療作用。本文結(jié)果驗(yàn)證了活化外周血PBMC系統(tǒng)和CD80對胃癌在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的殺傷作用,同時證明聯(lián)合應(yīng)用CD80可以提高活化外周血PBMC對胃癌細(xì)胞的殺傷作用。

    [1]傅體輝.T細(xì)胞識別腫瘤的分子機(jī)制.國外醫(yī)學(xué)免疫學(xué)分冊,1995,18(1):23-26.

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    [5]任 歡,邢淑賢,徐紅薇,等.CIK的體外增殖及體內(nèi)外殺瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國腫瘤生物治療雜志,1999,6(1):17-21.

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