不同稀釋液對(duì)血清中HBsAg定量測(cè)定的影響

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬南京鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇南京 210028)

我國(guó)是乙型肝炎病毒(hepatitis B Virus，HBV)感染的高發(fā)區(qū)，HBV感染的診斷主要依賴于患者血清中病毒標(biāo)志物和病毒核酸(HBV DNA)的檢出。乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)是HBV表面的外膜蛋白，由病毒S基因編碼，在病毒感染肝細(xì)胞過程中起重要作用。最近一些研究證明HB-sAg 和 HBV DNA 水平之間有良好的相關(guān)性［1－2］，定量檢測(cè)血清中HBsAg可以反映宿主體內(nèi)HBV DNA的水平，對(duì)評(píng)價(jià)抗病毒藥物治療的療效和判斷預(yù)后有重要意義［3］，同時(shí)對(duì)于一些HBV DNA呈陰性的慢性乙肝患者，血清中HBsAg的含量就為臨床醫(yī)生的診斷及治療提供了良好的依據(jù)。目前，我院采用ARCHITECT i2000SR化學(xué)發(fā)光分析儀對(duì)血清中的HBsAg進(jìn)行定量檢測(cè)。臨床上有些乙肝患者HBsAg定量測(cè)定結(jié)果超出該儀器所能檢測(cè)的線性范圍，為了得到準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，幫助臨床醫(yī)生更好地了解疾病進(jìn)展，常需要對(duì)高濃度HBsAg血清進(jìn)行稀釋后再測(cè)定。

1 材料和方法

1．1 血清標(biāo)本

篩選收集乙肝患者血清 HBsAg定量＞250 IU·ml－1的標(biāo)本血清，標(biāo)本來源于南京市鼓樓醫(yī)院門診。標(biāo)本要求無明顯溶血、脂血。

1．2 混合低值血清制備

收集本院住院病人中乙肝兩對(duì)半定量結(jié)果全陰性的血清標(biāo)本，混勻后2 000 r·min－1離心取其上清液(經(jīng)檢測(cè) HBsAg 為 0．02 IU·ml－1)。

1．3 儀器與試劑

美國(guó)雅培公司生產(chǎn)的ARCHITECT i2000SR全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀及配套試劑(含HBsAg專用稀釋液)、生理鹽水、蒸餾水、自制混合低值血清等。

1．4 實(shí)驗(yàn)方法

將不同患者的高濃度 HBsAg血清(＞250 IU·ml－1)分別用專用稀釋液、生理鹽水、混合低值血清及蒸餾水按照1∶100的比例(5 μl血清加入495 μl稀釋液)稀釋，充分混勻后取雙份上機(jī)檢測(cè)HBsAg含量。操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行，測(cè)定在1 h內(nèi)完成。

1．5 統(tǒng)計(jì)方法

用Microsoft Excel系統(tǒng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，組間比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

高值HBsAg血清標(biāo)本分別用HBsAg專用稀釋液、生理鹽水、混合低值血清及蒸餾水按照1∶100比例稀釋后經(jīng)ARCHITECT i2000SR化學(xué)發(fā)光儀測(cè)HBsAg濃度值，結(jié)果見表1。

表1 高濃度HBsAg用不同稀釋液稀釋后的測(cè)定結(jié)果及偏差Tab 1 The results of concentration of HBsAg diluted with different diluents

生理鹽水和蒸餾水作為稀釋液后的測(cè)定值與專用稀釋液稀釋后的測(cè)定值相比，P＜0．05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，所以在日常檢測(cè)中，不能用生理鹽水或蒸餾水作為化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定HBsAg的稀釋液;而混合低值血清稀釋后的測(cè)定值與專用稀釋液相比偏差較小，P＞0．05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故混合低值血清可以作為替代稀釋液用于化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定HBsAg。

3 討 論

雅培ARCHITECT i2000SR全自動(dòng)免疫分析儀核心技術(shù)為化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析(chemiluminesent micropaticle immunoassay)，以吖叮酯作為標(biāo)記發(fā)光劑，主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)、病毒抗原等大分子物質(zhì)，試劑具有極高的靈敏度、特異性和穩(wěn)定性。它對(duì)HBsAg的可測(cè)范圍是0～250 IU·ml－1，而臨床上有些血清的HB-sAg往往超出了該檢測(cè)范圍，所以需要稀釋后再測(cè)定，但是由廠家提供的專用稀釋液價(jià)格相當(dāng)昂貴且保存有效期很短，有時(shí)會(huì)有供貨不及時(shí)或稀釋液超過有效期的情況發(fā)生。本研究通過用生理鹽水、混合低值血清、蒸餾水作為稀釋液來稀釋高濃度的HBsAg血清，旨在探討三者對(duì)血清HBsAg測(cè)定的影響，以期選擇出合適的稀釋液來代替專用稀釋液。免疫反應(yīng)體系中的蛋白分子種類及含量、pH值、離子強(qiáng)度對(duì)免疫反應(yīng)本身有較大影響。待測(cè)血清經(jīng)稀釋后如果反應(yīng)體系發(fā)生明顯變化，則會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性［4］。

通過這3種稀釋液分別對(duì)11份不同乙肝患者血清稀釋后進(jìn)行測(cè)定，比較偏差計(jì)算結(jié)果發(fā)現(xiàn)用生理鹽水及蒸餾水稀釋后測(cè)得的結(jié)果都偏高，均存在明顯偏差，分別為 －2．05% ～157．81%、－16．32% ～313．64%，而用混合低值血清稀釋后的偏差為－35．03% ～32．60%，與專用稀釋液稀釋后測(cè)定值比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。可能因?yàn)榈椭祷旌涎宓牡鞍踪|(zhì)、pH值、離子強(qiáng)度和其他血清成分與樣本血清基本相近，因此其測(cè)定結(jié)果偏差最小。因只對(duì)較高濃度HBsAg的血清標(biāo)本(一般＞250 IU·ml－1)進(jìn)行稀釋，所以用混合低值血清稀釋測(cè)定的偏差并不影響對(duì)HBsAg定量結(jié)果的陰陽性判定，僅對(duì)其高濃度的值有所影響，而這個(gè)結(jié)果應(yīng)該是可以接受的。生理鹽水的離子強(qiáng)度、pH值與血清相近，但缺乏蛋白質(zhì)和血清成分，所以測(cè)定結(jié)果偏差較大。而蒸餾水與血清相比在蛋白質(zhì)、pH值方面均相差較大，不適宜作為免疫反應(yīng)的血清稀釋液，這與丁忠旗等［5－7］研究結(jié)果一致?？紤]到胎牛血清在離子強(qiáng)度、pH值方面與人血清接近，另選取5份高濃度HBsAg的血清標(biāo)本稀釋后進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與專用稀釋液比較偏差亦較大，可超過100%(結(jié)果未在表1中列出)，可能是胎牛血清中所含蛋白種類和人血清相比有一定差異，對(duì)整個(gè)反應(yīng)體系有影響所致。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雅培ARCHITECT i2000SR全自動(dòng)免疫分析儀在測(cè)定HBsAg濃度時(shí)，如遇到超出儀器線性范圍(＞250 IU·ml－1)的標(biāo)本需進(jìn)行稀釋，除專用稀釋液外，低值血清可以作為替代稀釋液使用，以測(cè)定高濃度HBsAg的實(shí)際值來觀察患者病情及轉(zhuǎn)歸。

［1］孫長(zhǎng)義，王山梅．乙肝病毒標(biāo)志物與PCR-HBV定量水平的關(guān)系［J］．中國(guó)公共衛(wèi)生，2002，18(12):1480-1481．

［2］侯遠(yuǎn)沛，宋麗．乙型肝炎標(biāo)志物定量檢測(cè)結(jié)果與HBV-DNA含量相關(guān)性分析［J］．實(shí)用醫(yī)技雜志，2004，11(10):2112-2113．

［3］陳祥勝，廖雯君．乙肝HBsAg定量檢測(cè)的臨床診斷意義［J］．湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，11(2):21-23．

［4］高云朝，楊亞東，陸漢魁．稀釋介質(zhì)對(duì)化學(xué)發(fā)光免疫分析檢測(cè)血清HCG的影響［J］．標(biāo)記免疫分析與臨床，2007，14(2):121，72．

［5］丁忠旗，李永培，盛強(qiáng)．不同稀釋液對(duì)高濃度HCG測(cè)定值的影響［J］．中華核醫(yī)學(xué)雜志，2002，22(1):39．

［6］朱誠憶，胡建軍．不同稀釋液對(duì)RIA測(cè)定高濃度AFP的影響［J］．上海醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，2000，15(3):140．

［7］陳春華．探討用不同稀釋液對(duì)RIA測(cè)定高濃度AFP的影響［J］．華西醫(yī)學(xué)，2003，18(2):247．