日糧中等硫添加DL-蛋氨酸和蛋氨酸羥基類似物游離酸在幼建鯉上飼喂效果的比較研究

肖偉偉 馮 琳,2 劉 揚,2 姜 俊,2 姜維丹,2 胡 凱,2李樹紅周小秋,2*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)研究所,雅安625014;2.動物抗病營養(yǎng)教育部重點實驗室,雅安 625014）

蛋氨酸是水生動物重要的含硫必需氨基酸,同時也是許多植物性原料的第一限制性氨基酸[1]。隨著魚粉價格不斷上漲且產(chǎn)量達到飽和,水生動物飼料逐漸以植物蛋白替代魚粉作為主要的蛋白質(zhì)源,造成飼料中蛋氨酸普遍缺乏,補充合成蛋氨酸源成為解決此問題的重要途徑[2]。DL-蛋氨酸（DLMet）和蛋氨酸羥基類似物（蛋氨酸羥基類似物游離酸是其中一種形式,英文簡寫為MHA-FA）是目前常見的合成蛋氨酸源,都已在陸生動物飼料中廣泛使用[3]。但水生動物上關(guān)于MHA-FA的應(yīng)用效果還存在爭議。Keem biyehetty等[4]和Kelly[5]在條紋石鮨（Morone chrysops♀×Morone saxatilis♂）上,Goff等[6]在眼斑擬石首魚（Sciaenops ocellatus）上的研究發(fā)現(xiàn),等硫添加DL-M et和MHAFA時,MHA-FA促生長的效果顯著低于DL-Met。水生動物的生長與腸道消化酶和刷狀緣吸收酶活力密切相關(guān)[7],但目前還未見MHA-FA和DL-Met在水生動物腸道消化酶和刷狀緣吸收酶活力上的比較研究。蛋氨酸的特殊結(jié)構(gòu)與功能使其具有重要的抗氧化作用[8]。零星的研究表明,DL-Met提高條紋石鮨肝臟谷胱甘肽（GSH）含量和降低條紋石鮨肝臟丙二醛（MDA）含量的幅度明顯高于等硫的MHA-FA[5,9]。但關(guān)于MHA-FA和DL-M et在水生動物多種抗氧化酶上的比較研究還未見報道。因此,本試驗擬從幼建鯉（Cyprinus carpiovar.Jian）的生長性能、消化吸收和抗氧化能力方面比較MHA-FA和DL-M et的飼喂效果。

1 材料與方法

1.1試驗日糧與試驗設(shè)計

試驗日糧以魚粉、大米蛋白粉、棉籽粕、菜籽粕、豆粕為蛋白質(zhì)源,其組成及營養(yǎng)水平見表1。日糧1中添加2%的DL-M et預(yù)混料（DL-Met在日糧中含量為0.52%,DL-Met純度為98.5%,日本住友化學(xué)提供）,使日糧蛋氨酸總含量達到本課題組推薦的幼建鯉需要量[10]。日糧2中添加2%的MHAFA預(yù)混料（MHA-FA在日糧中含量為0.58%, MHA-FA純度為88%,日本住友化學(xué)提供）,與日糧1達到等硫。原料60目粉碎,混勻后制成粒徑為1.5 mm的顆粒料,自然風(fēng)干備用。試驗選用300尾平均體重為（8.24±0.03）g的健康幼建鯉,隨機分成2組,每組3個重復(fù),每個重復(fù)50尾,分別飼喂日糧1（DL-Met組）和日糧2（MHA-FA組）,試驗期60 d。

表1 試驗日糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）Tab le 1 Composition and nutrient levels of experimental diets（air-d ry basis,%）

1.2飼養(yǎng)管理

魚苗購回馴化30 d后開始試驗,飼養(yǎng)于循環(huán)流水過濾水族箱（90 cm×55 cm×30 cm）中,水源為曝氣自來水。水溫為（25.0±1.5）℃,pH 7.0,溶氧保持在5m g/L以上。試驗期間根據(jù)建鯉采食情況調(diào)整投喂量,保證每次飼喂30m in后有剩料,并迅速收集剩料,計算攝食量。

1.3 指標(biāo)測定

1.3.1 生長性能

試驗開始和結(jié)束時對試驗魚稱重,計算增重和飼料轉(zhuǎn)化率。試驗前隨機選取與試驗魚體重一致的30尾魚用于魚體蛋白質(zhì)、脂肪和灰分含量測定。試驗結(jié)束時,每個重復(fù)隨機選取5尾魚,經(jīng)冷凍干燥后分別用凱氏定氮法、索氏抽提法和灼燒法測定魚體蛋白質(zhì)、脂肪和灰分含量,并計算蛋白質(zhì)、脂肪和灰分的沉積率。計算公式為:

蛋白質(zhì)（脂肪或灰分）沉積率=[（B-A）/I]×100。

其中,B為試驗結(jié)束時魚體中蛋白質(zhì)（脂肪或灰分）總量（g）;A為試驗開始時魚體中蛋白質(zhì)（脂肪或灰分）總量（g）;I為試驗期蛋白質(zhì)（脂肪或灰分）攝入總量（g）。

1.3.2 肝胰臟和肌肉谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）活力及血漿氨含量

最后1次投飼12 h后,每個重復(fù)隨機選取15尾魚,尾靜脈采血并將血液置于4℃冰箱中過夜后,4℃,3 000 r/min離心10 min。取血清按測定各指標(biāo)所需要的樣品量進行分裝,然后置于-20℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?。同時取肝胰臟、腸道和肌肉用液氮冷凍后在-70℃冰箱保存?zhèn)錅y。肝胰臟和肌肉GOT、GPT活力用試劑盒測定（南京建成生物工程研究所）。最后1次投飼6 h后,每個重復(fù)隨機選取5尾魚,乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）抗凝針管尾部血管采血,兩點法測定血漿氨含量（中生北控測試盒）,2 h內(nèi)完成。

1.3.3 消化吸收指標(biāo)

肝胰臟和腸道糜蛋白酶、胰蛋白酶活力測定參照Hummel[11]的方法進行。肝胰臟和腸道脂肪酶和淀粉酶活力測定參照Furne等[12]的方法進行。全腸肌酸激酶（CK）和各腸段堿性磷酸酶（AKP）、Na+,K+-ATP酶活力的測定分別參照W eng等[13]、K rogdah l等[14]、Ilenchuk等[15]的方法進行。各腸段γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）活力用試劑盒測定（南京建成生物工程研究所）,具體按試劑盒說明書進行。

1.3.4 抗氧化指標(biāo)

血清、腸道和肝胰臟的MDA含量測定參照Lingstone等[16]的方法,超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力的測定參照Zhang等[17]的方法,過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽還原酶（GR）、GSH和谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST）活力的測定分別參照Aebi[18]、Lora等[19]和Lushchak等[20]的方法。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 11.5對試驗數(shù)據(jù)進行t檢驗,結(jié)果以平均值±標(biāo)準差表示。

2 結(jié) 果

2.1生長性能

由表2可知,MHA-FA組幼建鯉的末重、增重、飼料轉(zhuǎn)化率以及蛋白質(zhì)、脂肪和灰分的沉積率與DL-Met組均差異不顯著（P＞0.05）,但攝食量顯著低于DL-Met組（P＜0.05）。

表2 等硫添加DL-Met和M HA-FA對幼建鯉生長性能的影響Table 2 Effects of equal-sulfur supp lementation with DL-Met and MHA-FA on grow th perform ance of juvenile Jian carp

2.2 肌肉和肝胰臟GPT、GOT活力以及血漿氨含量

由表3可知,MHA-FA組幼建鯉的肝胰臟GOT、肌肉和肝胰臟GPT活力以及血漿氨含量與DL-Met組均差異不顯著（P＞0.05）,但肌肉GOT活力顯著低于DL-M et組（P＜0.05）。

表3 等硫添加DL-M et和MHA-FA對幼建鯉肌肉和肝胰臟GPT、GOT活力以及血漿氨含量的影響Tab le 3 Ef fects of equal-sulfur supp lem entation w ith DL-M et and MHA-FA on GPT and GOT activities in muscle and hepatopancreas and p lasma ammonia content of juvenile Jian carp（U/g）

2.3消化吸收指標(biāo)

由表4可知,MHA-FA組的肝胰臟和腸道胰蛋白酶、糜蛋白酶以及腸道脂肪酶和淀粉酶活力與DL-Met組均差異不顯著（P＞0.05）,但肝胰臟脂肪酶和淀粉酶活力顯著低于DL-Met組（P＜0.05）。

表4 等硫添加DL-M et和MHA-FA對幼建鯉腸道和肝胰臟消化酶活力的影響Table 4 Ef fects of equal-sulfur supp lementation w ith DL-Met and MHA-FA on digestive enzyme activities in intestine and hepatopancreas of juvenile Jian carp（U/g）

由表5可知,MHA-FA組的前腸和中腸AKP、各腸段Na+,K+-ATP酶、中腸γ-GT以及全腸CK活力與DL-M et組均差異不顯著（P＞0.05）,但后腸AKP、前腸和后腸γ-GT活力顯著低于DL-M et組（P＜0.05）。

2.4 抗氧化指標(biāo)

由表6可知,MHA-FA組的血清、腸道和肝胰臟MDA含量顯著高于DL-Met組（P＜0.05）。 MHA-FA組的肝胰臟和腸道GSH活力與DL-Met組差異不顯著（P＞0.05）,但血清GSH活力顯著低于DL-Met組（P＜0.05）。MHA-FA組的血清、肝胰臟和腸道SOD、GR活力與DL-Met組無顯著差異（P＞0.05）。MHA-FA組的血清和腸道CAT以及腸道和肝胰臟GST、GSH-Px活力顯著低于DLM et組（P＜0.05）,而肝胰臟CAT,血清GSH-Px、GST活力與DL-Met組無顯著差異（P＞0.05）。

表5 等硫添加DL-Met和MHA-FA對幼建鯉腸道吸收酶活力的影響Tab le 5 Effects of equal-sulfur supplementation w ith DL-Met and MHA-FA on absorptive enzyme activities in intestine of juvenile Jian carp（U/g）

表6 等硫添加DL-M et和MHA-FA對幼建鯉血清、腸道和肝胰臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 6 Ef fec ts of equal-su lfur supp lementation w ith DL-Met and MHA-FA on antioxidation indices in the serum,intestine and hepatopancreas of juvenile Jian carp（U/mg prot）

3 討 論

3.1 等硫添加DL-Met和MHA-FA對幼建鯉生長性能的影響

蛋氨酸是鯉魚重要的含硫必需氨基酸,植物蛋白日糧中補充蛋氨酸可以促進鯉魚的生長[21-22]。在本試驗日糧中補充等硫水平的DL-M et和MHAFA并達到幼建鯉的蛋氨酸需要量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)增重二者差異不顯著。這與Keembiyehetty等[4]和Kelly[5]在條紋石鮨及Gof f等[6]在眼斑擬石首魚上的研究得出的DL-M et的增重效果顯著高于等硫的MHA-FA的結(jié)果不一致。結(jié)果不太一致的原因可能有:1）水生動物品種不同。MHA-FA進入機體需要經(jīng)L-2-羥基酸氧化酶和D-2-羥基酸脫氫酶轉(zhuǎn)化為2-酮-4-甲硫基丁酸,再由轉(zhuǎn)氨酶轉(zhuǎn)化為L-蛋氨酸才能被機體利用[23]。建鯉轉(zhuǎn)化并利用MHA-FA的能力可能高于其他水生動物。2）日糧類型不同。本試驗中采用實用日糧,以上研究均采用純合或半純合日糧。Gutteridge等[24]和Daenner等[25]在肉雞上的研究發(fā)現(xiàn),實用日糧下等硫的MHA-FA與DL-M et的增重效果相當(dāng)。

攝食量和飼料轉(zhuǎn)化率是影響水生動物生長的2個重要因素,而體沉積的變化在一定程度上反映了動物對飼料的利用效率。本試驗結(jié)果顯示,MHAFA組的幼建鯉攝食量顯著低于DL-Met組,但蛋白質(zhì)、脂肪和灰分的沉積率2組差異不顯著,二者的飼料轉(zhuǎn)化率也相當(dāng)。這表明,幼建鯉利用含等硫的MHA-FA和DL-Met飼料的效率是一樣的。蛋白質(zhì)沉積率與機體的氨氮代謝以及體蛋白質(zhì)合成的能力有關(guān)[26]。肝胰臟和肌肉是體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝的主要場所,而GOT和GPT是2種主要參與氨基酸代謝的酶,其活力高低可以反映體內(nèi)氨基酸被利用的情況[27]。氨是魚類蛋白質(zhì)在肝臟和腎臟分解代謝的主要終產(chǎn)物,血漿氨含量與日糧氨基酸含量及比例有關(guān)[28]。本研究發(fā)現(xiàn),等硫的MHA-FA和DLMet組的幼建鯉的肌肉、肝胰臟中GOT和GPT活力以及血漿氨含量無顯著差異。這表明,等硫的MHA-FA和DL-Met調(diào)節(jié)氨基酸的周轉(zhuǎn)代謝和蛋白質(zhì)合成的效率幾乎相當(dāng),表現(xiàn)出體蛋白質(zhì)沉積的效果也一樣。

3.2 等硫添加DL-M et和MHA-FA對幼建鯉消化酶和吸收酶活力的影響

水生動物的生長來源于對營養(yǎng)物質(zhì)充分的消化吸收,營養(yǎng)物質(zhì)的消化以酶消化為主,吸收靠多種吸收酶完成,因此生長與消化酶和吸收酶的活力密切相關(guān)[8]。本研究發(fā)現(xiàn),MHA-FA組的肝胰臟和腸道胰蛋白酶、糜蛋白酶以及腸道脂肪酶和淀粉酶活力與DL-Met組差異不顯著,但肝胰臟脂肪酶和淀粉酶活力顯著低于DL-M et組。這表明,DL-Met可能更有利于脂肪酶和淀粉酶的分泌,但由于腸道消化酶活力大多與等硫的MHA-FA相當(dāng),二者在消化能力上幾乎可達到相同的效果。

Na+,K+-ATP酶是存在于多種生物膜上的一種蛋白酶,參與多種氨基酸的轉(zhuǎn)運過程[29],其活力間接反映腸道的吸收能力。由本研究結(jié)果可知,投飼等硫的MHA-FA和DL-Met飼料的幼建鯉的各腸段Na+,K+-ATP酶活力差異均不顯著。γ-GT是谷氨酸循環(huán)的關(guān)鍵酶,可促進氨基酸向細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運,為蛋白質(zhì)生物合成提供原料[30]。本研究發(fā)現(xiàn), MHA-FA組的中腸γ-GT活力與DL-M et組差異不顯著,但前腸和后腸γ-GT活力顯著低于DLM et組。腸道AKP分布在腸上皮刷狀緣細胞表面,與脂類、氨基酸、葡萄糖等多種物質(zhì)的吸收有關(guān),也反映腸上皮細胞的吸收能力[31]。本研究顯示, MHA-FA組的前腸和中腸AKP活力與DL-Met組無顯著差異,但后腸AKP活力顯著低于DL-Met組。CK在能量代謝中扮演重要角色,參與多種酶與ATP的組裝過程,為腸道營養(yǎng)物質(zhì)的吸收提供能量。本研究發(fā)現(xiàn),投飼等硫的MHA-FA和DL-Met飼料的幼建鯉整個腸道CK活力差異不顯著。以上結(jié)果表明,等硫添加MHA-FA和DL-M et時,幼建鯉的絕大部分腸道吸收酶活力相當(dāng)。

3.3 等硫添加DL-Met和MHA-FA對幼建鯉抗氧化能力的影響

蛋氨酸代謝生成的Cys可參與抗氧化物質(zhì)GSH和?；撬岬暮铣蒣2,32],且其本身的巰基具有氧化還原的特點[33],使其在機體抗氧化系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用。體內(nèi)脂質(zhì)中的多不飽和脂肪酸易受活力氧物質(zhì)（ROS）攻擊發(fā)生氧化而生成終產(chǎn)物MDA,因此MDA含量常用來反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度[34]。本研究結(jié)果顯示,DL-M et組的血清、腸道和肝胰臟MDA含量顯著低于MHA-FA組,這與Li等[9]在條紋石鮨上的研究結(jié)果一致。這表明,補充DL-Met的水生動物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度小于等硫的MHA-FA。正常情況下,體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)使體內(nèi)ROS的產(chǎn)生和清除處于動態(tài)平衡,維持在適宜水平而不會造成機體的氧化損傷。SOD主要負責(zé)清除超氧陰離子（O2-）,將其轉(zhuǎn)化為H2O2;CAT和GSH-Px作為SOD的下游酶類,分別在微粒體和胞漿、線粒體基質(zhì)中清除H2O2,同時GSH-Px還具有清除脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的能力[35];GR主要負責(zé)將氧化型谷胱甘肽轉(zhuǎn)化為GSH,維持體內(nèi)GSH的平衡;GSH作為體內(nèi)重要的抗氧化物質(zhì),可以直接還原H2O2和過氧化脂質(zhì),還參與了維生素C的再生過程;GST的同工酶能夠?qū)⒅|(zhì)過氧化產(chǎn)物清除出細胞[36]。由本試驗結(jié)果可知,MHA-FA組的血清、腸道和肝胰臟SOD、GR,腸道和肝胰臟GSH、肝胰臟CAT及血清GSH-Px和GST活力與DL-Met組差異不顯著,但血清GSH、血清和腸道CAT、腸道和肝胰臟GST、GSH-Px活力顯著低于DL-Met組。上述結(jié)果表明DL-M et組的多種抗氧化酶活力高于等硫的MHA-FA組,這可能是其血清、腸道和肝胰臟MDA含量較低的主要原因。DL-Met的抗氧化能力在一定程度上優(yōu)于等硫的MHA-FA,可能是二者在體內(nèi)參與的代謝有所不同,還有待進一步研究。

4 結(jié) 論

①在本試驗日糧中添加的MHA-FA能夠很好地被幼建鯉吸收利用。

②在生長性能方面,等硫的MHA-FA可以完全替代DL-M et;在消化吸收和抗氧化能力方面,等硫的MHA-FA可以部分替代DL-Met。

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*Correspond ing au thor,p rofessor,E-m ail:Zhouxq@sicua.edu.cn

（編輯 菅景穎）