優(yōu)化超聲提取酶解得到黃芩素的方法*

丁 翔，常金花，瞿晶田，劉翠哲

（承德醫(yī)學院，河北承德 067000）

黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria Baicalensis Georgi）的干燥根，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎之功效[1]。黃芩中含有黃芩苷、黃芩素等有效成分，其中黃芩苷是主要成分，黃芩素為黃芩苷的苷元。文獻報道，黃芩苷為復原型前體藥物，即黃芩苷口服后可以在腸內經細菌作用轉化為黃芩素后被吸收，再在體內結合形成黃芩苷[2]。有關黃芩苷和黃芩素的胃腸吸收動力學研究也表明，口服黃芩苷生物利用度較低，口服黃芩素的達峰濃度以及生物利用度均高于黃芩苷[3]。

黃芩中自身存在一種酶可以將黃芩苷酶解為黃芩素，這種酶是β-葡萄糖醛酸酶，可考慮用這種酶將黃芩苷轉化為黃芩素用于口服制劑中[4-5]。目前，酶解后得到黃芩素多采用浸漬法、酶解醇提法提取[6-7]；但這兩種提取方法費時，且工序復雜。本研究采用酶解后超聲提取黃芩素的方法，并對主要影響因素進行考察，優(yōu)化了提取方法。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 高效液相色譜儀（日本JASCO）：UV-1575檢測器，PU-1580色譜泵，ZW溫度控制器，CKChrom色譜工作站；Discovery C18（250mm×4.6 mm，5μm）色譜柱；KQ100E、KQ300、KQ500B超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；YP1200電子秤，上海精科天平公司；AG-245電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；惠普-8453紫外可見分光光度計。

1.2 試藥 黃芩的干燥根，購于中國藥業(yè)集團承德有限責任公司，并經承德醫(yī)學院趙春穎副研究員鑒定為統(tǒng)芩，產于河北承德，為熱河黃芩；黃芩素對照品，批號：111595-200604，購于中國藥品生物制品檢定所；黃芩苷對照品，批號：715-200111，購于中國藥品生物制品檢定所；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 黃芩素的分析方法

2.1.1 色譜條件[8]：Discovery C18（250mm×4.6mm，5μm）色譜柱；流動相：甲醇-水-冰醋酸（48:52:0.4）；柱溫：35℃；流速：0.8ml/min；檢測波長：275nm。

2.1.2 標準曲線的制備：精密稱取黃芩素對照品5.23mg，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即為對照品溶液。分別精密吸取對照品溶液3.0，6.0，9.0，12.0，15.0μl注入液相色譜儀，以峰面積（Y）對進樣量（X）進行線性回歸，回歸方程為Y=4000000X-484769，r=0.9995，線性范圍：0.6276-3.138μg。

2.1.3 精密度實驗：分別取黃芩素對照品溶液10μl連續(xù)進樣6次，記錄色譜峰面積，黃芩素峰面積的RSD為1.93%。

2.1.4 供試品溶液制備：分別稱取酶解后的黃芩藥材600mg、黃芩素提取物250mg，加70%乙醇超聲溶解，定容至100ml；精密量取10ml續(xù)濾液于100ml容量瓶中，用70%乙醇定容，即得。

2.1.5 樣品測定方法：精密吸取供試品溶液各5μl，進樣，測定峰面積，隨行標準品，按照標準品計算黃芩素的含量。

2.2 黃芩素提取物的制備 取160.0g黃芩藥材粉碎過1號篩，加6倍量水攪勻，60℃下保溫10h（酶解），取出，濾過后將藥材于70℃烘干（酶解后的黃芩藥材），再經超聲提取、干燥，即為黃芩素提取物。

選擇4個對實驗影響最大的因素進行正交實驗。分別稱取酶解后的黃芩藥材9份，每份5.0g，用10倍量乙醇作為提取液[9]；選取超聲功率、乙醇濃度、提取時間、提取次數(shù)4個因素進行進行考察，按照L9（34）表進行正交實驗，因素和水平見表1。以從酶解后黃芩藥材中提取到的黃芩素的量為指標，正交實驗結果見表2，方差分析結果見表3。結果表明，因素C、D即乙醇的濃度和提取次數(shù)對從酶解后黃芩藥材中提取到的黃芩素的量有非常顯著的影響，提取時間和超聲波功率對提取黃芩素的量有一定影響。70%乙醇和95%乙醇所得黃芩素含量接近，從成本等因素考慮，優(yōu)選出提取工藝為A2B2C3D2，即超聲功率300w，超聲時間20分鐘，超聲次數(shù)4次，乙醇濃度70%。

表1 因素和水平

表2 正交實驗結果

表3 方差分析結果

F1-0.01（2，∞）=4.60，F(xiàn)1-0.05（2，∞）=2.99，F(xiàn)1-0.1（2，∞）=2.3 2.3 工藝驗證試驗 取黃芩藥材，粉碎過1號篩，稱取10.0g，加入105.3ml水，將容器密閉，60℃下酶解10h，向酶解好的藥材中加入95%乙醇294.7ml，配成相當于70%的乙醇溶液。用紗布過濾，濾液分成4份，按2.2確定的工藝進行提取。幾份樣品提取后經測定并取平均值：干燥物中黃芩素的含量為50.83%，轉移率為70.43%。

2.4 工藝放大試驗 取黃芩藥材，粉碎過1號篩，稱取1000.0g，加入10530ml水，將容器密閉，60℃下酶解10h，向酶解好的藥材中加入95%乙醇29470ml，配成相當于70%的乙醇溶液。將提取液旋轉蒸發(fā)，所得浸膏靜置、抽濾，將濾餅干燥，得158.9g。照2.1黃芩素的分析方法制備黃芩素供試品溶液并進行測定，干燥物中黃芩素的含量為54.07%，轉移率為89.77%。

3 討論

正交實驗結果表明，超聲功率對實驗結果影響不大，乙醇濃度對黃芩素提取率有顯著影響，但從降低成本的角度考慮，選擇了次佳水平，即70%的乙醇。經工藝放大試驗證實該法方便有效，提取物含量達50%以上。

在進行正交實驗時，酶解黃芩粉末后過濾，濾液中含有黃芩素，有文獻報道不足2%，雖然可以除去水溶性雜質，但在大量生產時這種損失比較大，在對黃芩素的優(yōu)化提取過程中，沒有將其過濾，而采用過量的水溶解，再加入95%乙醇，配成相當于70%的乙醇溶液，這樣即可以使黃芩苷酶解完全，又避免了黃芩素的損失，在提取到黃芩素的浸膏后，用水進行精制，這一步可以很好的除去水溶性雜質，避免了多次損失浪費。

[1]國家藥典委員會編．中華人民共和國藥典（一部）[S]．北京：化學工業(yè)出版社，2005.212.

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[4]呂衛(wèi)明，房喻，代珺，等.酶水解法提取分離黃芩素的研究[J].中國中藥雜志，1991，16（12）:742.

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