從第五屆國際藥用菌大會看中國藥用菌研究進展

許正宏, 陸震鳴, 許泓瑜

(江南大學醫(yī)藥學院,江蘇無錫214122)

國際藥用菌大會(IMMC)有“藥用菌界的奧林匹克盛會”之稱,是國際食藥用菌界專家、學者及產業(yè)界研究、交流和互動的平臺。大會自2001年以來每兩年舉辦一次,第五屆國際藥用菌大會于2009年9月5日至8日在中國江蘇南通召開,為中國首次舉辦。來自美國、日本、荷蘭、韓國、印度、中國臺北及香港等41個國家和地區(qū)的900余名專家、學者及企業(yè)界代表參加,研究探討世界食藥用菌領域最新成果,為產業(yè)發(fā)展獻計獻策。學術研討會的內容涵蓋食藥用菌的活性成分、生物技術在食藥用菌產品開發(fā)中的應用、藥用菌的生態(tài)學、營養(yǎng)學、遺傳學和毒理學等相關研究領域。

國際藥用菌大會在中國的召開,不僅為中國提供了一個向世界展示自我的平臺,同時也為中國的藥用菌界專家、學者近距離了解和借鑒國際藥用菌研究的發(fā)展動向提供了很好的機會。業(yè)內人士認為未來3～5年將是中國食藥用菌行業(yè)發(fā)展的黃金時代,國際食藥用菌產業(yè)發(fā)展重心將由歐美、日本、韓國逐漸向中國轉移。

1 第五屆國際藥用菌大會概況

第五屆國際藥用菌大會為期4天,共針對5個專題進行了研討。

1)藥用真菌的采集、系統(tǒng)分類、生態(tài)分布和菌種保藏 包括臺灣重傘靈芝和樟芝的分類、中國小脆柄菇科菌類的生物多樣性、竹黃遺傳多樣性分析、翹鱗香菇雜交模式研究等。

2)藥用真菌的營養(yǎng)與藥理作用及價值 包括雙孢菇抗癌作用、猴頭菇抗癡呆癥、通過對藥用菌基因表達的調控產生抗炎癥和抗癌作用、猴頭菇促進腓神經損傷后功能恢復、擔子菌黑色素-葡聚糖復合物抗腫瘤活性、灰樹花促進脾細胞增殖等。

3)藥用真菌的生理學、生物化學和遺傳學的研究 包括液體搖瓶和靜態(tài)培養(yǎng)過程中靈芝酸的生物合成和相關基因表達、蟲草屬真菌活性化合物的高通量篩選及鑒定、白腐菌 YK-624的木質素降解酶系統(tǒng)、美洲香菇中的新型多糖、針層孔菌和硫磺菌胞外木質素降解酶和生物表面活性劑對多環(huán)芳香族化合物生物降解的影響、云芝新型免疫蛋白的純化等。

4)藥用真菌的栽培、發(fā)酵及產業(yè)化研究 包括扁芝培養(yǎng)特性研究、培養(yǎng)條件對姬松茸子實體形成的影響、蘑菇子實體或菌絲體的加工處理對其活性的影響等。

5)民間傳統(tǒng)藥用真菌的使用情況和中西方應用上的異同 包括藥用菌在非洲及印度、中國、美國等國的傳統(tǒng)應用和現(xiàn)代研究等。

此外,大會還針對靈芝、蟲草以及藥用菌活性等3個專題展開了學術交流。

1)靈芝屬真菌的前景與挑戰(zhàn) 包括靈芝的藥理及臨床研究、靈芝菌種的分子鑒定及分類、靈芝栽培及發(fā)酵培養(yǎng)技術、靈芝活性物質(多糖和三萜類化合物)的鑒定及活性評價、赤芝蛋白聚糖 GLIS增強體液和細胞免疫及抗腫瘤等。

2)蟲草屬真菌的前景與挑戰(zhàn) 包括冬蟲夏草及其它蟲生真菌的無性型分離培養(yǎng)、野生冬蟲夏草和人工培養(yǎng)菌絲體的 HPLC指紋圖譜比對、高速逆流色譜與大孔樹脂聯(lián)用分離蛹蟲草中蟲草素等。

3)藥用真菌與抗艾滋病、抗腫瘤研究 包括數(shù)種藥用真菌(靈芝、灰樹花、雙孢菇、桑黃、云芝等)及其活性物質在抗艾滋病和抗腫瘤方面的研究。

圍繞上述議題,會議共安排了個口頭報告(含4個大會主題學術報告、32個主題報告)和展板張貼,基本反映了當今國際藥用菌研究和發(fā)展的現(xiàn)狀,同時也充分展示了中國學者在藥用菌研究方面的成果。

會議還確定下一屆國際藥用菌大會將于2011年9月在克羅地亞的薩格勒布市舉行。

2 從本次會議內容看中國藥用菌研究的熱點領域

從會議報告數(shù)量和代表參與程度來看,最受各國藥用菌研究者關注的熱點領域主要反映在如下3個領域:藥用真菌的營養(yǎng)與藥理作用;藥用真菌的生理學、生物化學和遺傳學的研究;靈芝屬和蟲草屬真菌的前景與挑戰(zhàn)。中國藥用菌研究的熱點也主要集中于這3個領域,與國際藥用菌研究的發(fā)展方向相符。

2.1 藥用真菌的營養(yǎng)與藥理作用

藥用真菌的使用在中國民間已有幾千年歷史,其功效亦為許多醫(yī)學古籍所記載?，F(xiàn)代藥理研究表明,藥用真菌具有調節(jié)免疫、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、降血脂等功效。但是許多藥食用真菌,尤其是人工培養(yǎng)的真菌產品(包括栽培產品及發(fā)酵產品)的藥理活性及其作用機制尚未闡明。中國學者正積極對藥用真菌的營養(yǎng)與藥理作用及其作用機制進行研究。楊曉彤等人對中國 II類抗腫瘤藥物云芝胞內糖肽(PSP)的抗腫瘤機制進行了較為深入地研究,發(fā)現(xiàn)PSP對小鼠巨噬細胞(RAW264.7)具有雙向免疫調節(jié)作用[1]。PSP能夠刺激巨噬細胞中NO和 TNF-α的產生,增強iNOS和 COX-2的表達和巨噬細胞的吞噬作用;相反PSP也能逆轉由于LPS處理而造成的巨噬細胞中NO和 TNF-α水平的過度升高,以及iNOS和COX-2的過表達。通過對PSP的這種雙向免疫調節(jié)作用進行調節(jié)可以產生抗炎癥和抗腫瘤作用。另外,PSP還能夠通過阻礙腫瘤細胞的細胞周期,從而增加化療藥物對HL-60細胞誘導凋亡的效果。除了多糖等生物大分子的藥理研究以外,真菌小分子活性化合物的作用機制也受到廣泛研究。例如有研究證實靈芝中的靈芝酸S和靈芝酸Mf能夠通過線粒體介導的細胞凋亡途徑從而抑制 Hela細胞的生長。另外,靈芝中性三萜可通過激活Caspase-3誘導人結腸癌細胞SW620發(fā)生凋亡。

另外,部分藥理研究所采用的真菌樣品為粗提取物,存在活性化合物不明確、構效關系難以闡明等缺點,需要進一步通過分離純化明確活性化合物的結構,從而對其作用機制作進一步闡明。

2.2 藥用真菌的生理學、生物化學和遺傳學研究

真菌在長期的進化過程中,為了抗拒外來物的侵襲以及適應外界環(huán)境,產生了大量化學防御物質和生長調節(jié)物質,這些生物活性物質對人類來說可能具有抗病防病功能。中國學者長期致力于對活性化合物進行分離鑒定,如車永勝、胡豐林等學者采用體外活性評價模型,對蟲草中的活性化合物進行篩選、純化和鑒定,獲得了一系列新結構化合物;蔣繼紅等人采用高速逆流色譜和大孔樹脂等技術從蛹蟲草中分離純化的蟲草素,從樺褐孔菌中分離樺褐孔菌醇。

除了對藥用真菌中活性化合物進行分析、分離及鑒定,目前中國學者對真菌活性化合物生物合成途徑的研究也逐漸深入到基因水平。例如,鐘建江等人通過分析靜置培養(yǎng)與搖瓶培養(yǎng)靈芝三萜合成過程中3個相關基因轉錄水平的差異,發(fā)現(xiàn)角鯊烯合成酶(SQS)基因在靈芝三萜合成中起到關鍵作用。相對于搖瓶培養(yǎng),靜置培養(yǎng)可以提高靈芝SQS基因轉錄水平,從而高產靈芝三萜。但是,對于藥用真菌次級代謝產物的生物合成途徑及其相關基因的研究目前還較少,需要進一步加強研究力度。

2.3 靈芝屬和蟲草屬真菌的前景與挑戰(zhàn)

靈芝和蟲草為中國藥用菌文化的代表,具有悠久的應用歷史。靈芝屬和蟲草屬真菌在中國分布廣泛,歷來就是中國藥用菌專家研究的熱點領域。在此次大會關于這兩個真菌屬的專題討論會上,中國學者的報告數(shù)量也占多數(shù),體現(xiàn)了中國在這個研究領域中具有一定的優(yōu)勢。報告內容涉及靈芝屬和蟲草屬真菌的分類鑒定、活性物質分析制備、栽培和發(fā)酵技術及其產品開發(fā)、藥理活性研究等多個方面,一些新技術和新手段逐漸被用于藥用真菌的研究,如采用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)和HPLC-DAD技術對不同蟲草菌種進行了分類鑒定。張勁松和楊曉彤等人分別開展了靈芝三萜和蟲草的指紋圖譜的研究。林志彬等人對靈芝的藥理活性開展了臨床方面的研究。另一方面,國際藥用菌研究強國也紛紛對靈芝屬和蟲草屬真菌加大了研究力度,因此中國對該類真菌的研究是機遇與挑戰(zhàn)共存。

3 關于中國藥用菌研究與發(fā)展趨勢的幾點思考

3.1 分類鑒定工作需要進一步完善

藥用真菌在中國的應用已有幾千年歷史,但一直沒有系統(tǒng)闡明各種藥用真菌起作用的活性成分及其作用機制,其中主要限制因素為缺乏系統(tǒng)的藥用真菌資源庫,以及對研究過程所采用真菌菌種的分類鑒定依舊存在著混亂的現(xiàn)象。產生這種現(xiàn)狀的原因主要為分類鑒定方法比較單一和缺乏完整的模式標本材料。

中國已有的真菌資源庫大多根據(jù)真菌的形態(tài)學特點、生境特點、生理生化特性和培養(yǎng)特性等進行分類鑒定。近年來,由于藥用真菌資源普查和開發(fā)、菌種馴化和雜交育種等研究的需要,需要對藥用真菌進行更為合理和精確地鑒定,但是僅靠傳統(tǒng)的分類方法已經顯得困難和不足,鑒定結果往往出現(xiàn)偏差或對相似菌株的分辨無能為力。比如,Ryvarden采用多種形態(tài)學分類指標(包括子實體的顏色、形狀、大小,擔孢子形態(tài),寄主和采集區(qū)域等)重新研究了53個靈芝標本,發(fā)現(xiàn)無法用傳統(tǒng)形態(tài)分類指標來定義靈芝。認為僅憑形態(tài)特征來鑒定靈芝,其結果值得懷疑[2]。

另外,由于缺乏完整的模式標本材料,藥用真菌的菌種分類也容易出現(xiàn)偏差。形態(tài)分類往往以采集到的材料或標本作為研究對象,然而這種材料只能代表菌物的某一發(fā)育階段,它所能提供用于分類鑒定的信息比較有限,因此鑒定分類時常常出現(xiàn)同物異名的錯誤。另外,許多菌株在收集過程中由于種種原因導致子實體信息缺失或變化,此時運用經典分類方法對其鑒定不夠準確[3]。

近年來,隨著分子生物學技術的發(fā)展,真菌的分類學研究已經逐步由表型深入到基因水平[4]。DNA作為遺傳物質比表型特征更為真實地反映真菌的系統(tǒng)發(fā)育。分子生物學技術用于藥用真菌的鑒定和分類具有操作方便、特異性好且準確可靠等優(yōu)點。目前較常用的分子鑒定手段為藥用真菌核糖體DNA(rDNA)的序列分析,可用于藥用真菌物種親緣性的討論和菌株的鑒別[5,6]。rDNA基因具有高復制倍數(shù)及演化中高保留性等優(yōu)點,rDNA序列中的18S rDNA序列和內轉錄間隔區(qū)序列(ITS)在真菌中可分別被作為屬和種之間的分類依據(jù)。此外,RAPD、序列特異擴增區(qū)域(SCAR)、限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、擴增片段長度多態(tài)性(AFLP)等技術也可用藥用菌的分類和鑒定。多種鑒定手段的應用可以準確反映真菌的系統(tǒng)發(fā)育以及鑒定區(qū)分不同菌株。目前采用分子鑒定的手段,已經證實之前文獻報道中被描述為靈芝(Ganoderma lucidum)的菌種大多數(shù)不是靈芝。

中國藥用菌種分類研究有待系統(tǒng)開展,需要采用分子生物學的手段,普遍建立和完善真菌核酸序列的資料庫,便于分析、比對、鑒定,并進行深入細致的探討。對于具有明確藥用活性的真菌,應該建立其詳細的菌株信息并確定模式菌株進行深入研究。

3.2 真菌質量標準的完善

本屆大會名譽主席張樹庭教授認為“我們要讓世界各地生產的藥食用真菌產品質量像可口可樂的質量一樣穩(wěn)定?！贝_切地講,就是要建立藥食用真菌產品的質量標準體系,促進規(guī)?；⒁?guī)范化的生產,包括真菌活性化合物的鑒定及控制、重金屬和農殘等有毒有害物質的控制等方面。

3.2.1 活性物質檢測 藥用菌中含有的活性物質是評價其質量的重要指標。不同藥用菌的活性物質種類眾多,因此目前在藥用真菌研究或生產過程中,對真菌產品的活性物質進行檢測控制就顯得尤為重要。中國也在藥用菌活性物質檢測標準的建立進行了較大努力,例如大會主辦方之一的南通安惠公司早在2004年就制訂了《保健食品中粗多糖的測定》、《保健食品中甘露醇的測定》、《保健食品中腺苷的測定》和《保健食品中總三萜的測定》4個檢測方法用于真菌類保健食品的質量控制,并被中國標準化研究院推薦為國家檢測方法。但是藥用菌的活性化合物數(shù)量巨大、種類多樣,僅僅采用粗提取物的含量作為質量控制的依據(jù)往往不能對藥用菌的活性進行明確表征。例如,β-葡聚糖被認為是藥用菌具有抗腫瘤活性的主要成分,而市場上銷售的真菌多糖類產品中大多采用粗多糖含量作為評價指標,未對多糖結構進行表征,造成了市場上大約90%～95%的β-葡聚糖產品被認為是假冒或仿制產品的結果[7]。因此,需要對不同藥用菌中的活性成分進行深入研究,開展藥用菌來源活性化合物的快速分離、結構鑒定,研究活性化合物的作用機制,并在化學與藥效學研究基礎上,建立新的藥用菌質量控制標準和生產工藝。

另外,不同真菌產品所具有的獨特揮發(fā)性化合物也可能被作為藥用菌質量控制的指標。比如不同等級或不同產地的松口蘑子實體所具有的香味物質具有較大差異,采用氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(GC-MS)技術可以對其進行有效鑒別和區(qū)分[8]。

3.2.2 安全性評價 重金屬和農殘等有害物質的控制是藥用菌產品質量控制過程中不容忽視的工作。近年來,以靈芝、蟲草為代表的藥用菌出口形勢良好,以藥用菌提取物制成的各類營養(yǎng)膳食補充劑風靡歐美和日本。在取得良好發(fā)展的同時,中國藥用菌產業(yè)需要借鑒食用菌產業(yè)發(fā)展中所遇到的問題和經驗,其中之一就是重金屬和農殘等有害物質的控制問題。中國是世界食用菌出口大國,但是從2002年的輸日香菇含甲醛事件、2003年的日本《種苗法》制定、2004年的輸歐盟香菇重金屬鎘超標事件、2006年的日本肯定列表制度等事件發(fā)生之后,中國食用菌產品已被認為是當前出口食品風險較高的產品之一。世界各國紛紛對包括食用菌在內的食品中重金屬限量進行調整,例如歐盟從2009年4月起執(zhí)行新法規(guī)(EC629/2008),對數(shù)種食用菌產品(香菇、雙孢菇、平菇)中鉛和鎘的最大限量標準分別調整為0.3 mg/kg和0.2 mg/kg,而中國食用菌衛(wèi)生標準(GB7096-2003)對鉛的最大限量為1.0 mg/kg,而未對鎘含量進行限定。受這些質量因素的影響以及在全球金融危機的沖擊下,從2008年中國藥用菌出口全球的數(shù)量統(tǒng)計來看,冬蟲夏草出口數(shù)量和收入與2007年同比分別降低66.8%和50.8%[9]。因此,加強藥用菌安全檢測的深入研究,為藥用菌產品的質量控制提供簡便、可靠的檢測方法成為當前藥用菌研究的一個重要話題。

3.3 真菌類復方產品的研發(fā)

藥用菌中含有數(shù)量巨大的代謝產物,許多菌物研究者致力于對真菌代謝產物進行分離純化,以期能得到結構明確的活性化合物作為藥物前體。但是值得注意的是,不是所有的藥用真菌都能被成功開發(fā)為單一結構的藥物[10],真菌中所含有的不同化合物往往需要組合成為活性組分才能對某一病癥具有較好的療效。據(jù)悉,已有學者開展了將中藥成分和藥用菌代謝產物協(xié)同增效的研究,不少藥用菌產品已結合中醫(yī)藥理論實現(xiàn)了復方研發(fā)。比如Huang等人[11]將樟芝發(fā)酵濾出液與中藥提取物(黃芪,丹參和枸杞等)進行重新組方,發(fā)現(xiàn)復方對CCl4肝損傷小鼠的轉氨酶水平升高具有抑制作用,其效果優(yōu)于樟芝單方組。中醫(yī)藥學是中華民族智慧的結晶,是中華民族優(yōu)秀文化及世界傳統(tǒng)醫(yī)學的重要組成部分。結合中醫(yī)藥理論實現(xiàn)真菌復方產品的研發(fā),能夠保障中國在研發(fā)技術上的領先性。

另外,采用中藥基質進行藥用菌的生產也是一個具有應用潛力的研究方向。利用中藥基質進行藥用真菌的生產,藥用真菌具有分解纖維素、淀粉、蛋白質、脂類等物質的強大酶系,可對中藥培養(yǎng)基質進行分解利用或生物轉化產生新化合物;同時中藥中的成分(生物堿、皂苷、黃酮等)可促進或抑制藥用真菌的生長及代謝產物的生產。真菌產品中既包含中藥成分,也包含藥用真菌的活性代謝產物,以及它們間相互作用產生的新成分[12]。例如,以中藥黃芪為藥用基質固體發(fā)酵槐耳或云芝,可獲得免疫活性增強的真菌產品[13]。藥用昆蟲地鱉蟲和蜣螂的乙酸乙酯提取物能促進液態(tài)發(fā)酵靈芝的胞外多糖產量[14]。

由于真菌復方產品的活性成分和作用機制更為復雜,其研發(fā)工作也給菌物學專家提出了更為艱巨的任務。

4 結 語

第五屆國際藥用菌大會在中國召開,為中國的藥用真菌的研究打開了一扇通向世界的大門。中國是藥用真菌的生產大國,但在技術研發(fā)等方面遠非世界強國,亟需中國藥用菌學者及業(yè)界人士共同努力,迎頭趕上。此次大會研討的有關藥用真菌的營養(yǎng)與藥理作用及價值、藥用真菌的生理學、生物化學和遺傳學等話題將是今后相當長的時間內藥用真菌的研發(fā)熱點,值得中國學者和業(yè)界人士加以重視。

致謝:作者引用了第五屆藥用菌大會論文集的部分文摘內容,由于涉及作者和單位較多,無法在參考文獻中一一列出,在此對文中出現(xiàn)的作者及單位一并表示感謝!

[1]YANG X T,REN W Z,MA W C,et al.The bidirectional immunomodulatory effects of Treametes versicolor polysaccharopeptide(PSP)on mouse macrophage Raw264.7 cells[A].Proceedings of the 5th International Medicinal Mushroom Conference[C].Nantong:2009.

[2]Ryvarden L.Genera of polypores:nomenclature and taxonomy[J].Synopsis Fungorum,1991,5:1-363.

[3]Chang T T,Chou W N.A ntrodiacinnamomea reconsidered andA.salmoneasp.nov.onCunninghamia konishiiin Taiwan[J].Botanical Bulletin of Academia Sinica,2004,45:347-352.

[4]唐傳紅,蘇春麗,張勁松,等.靈芝屬分類學研究進展.食用菌學報,2007,14:86-90.TANG C H,S U C L,ZHANGJ S,et al.Overview of the systematics ofGanoderma[J].Acta Edulis Fungi,2007,14:86-90.(in Chinese)

[5]Chiu HH.Phylogenetic analysis of Antrodia species andA ntrodia camphoratainferred from internal transcribed spacer region[J].Antonie Van Leeuwenhoek,2007,91:267-276.

[6]尹軍華,張平,龔慶芳,等.亞稀褶黑菇和稀褶黑菇的ITS序列分析[J].菌物學報,2008,27(2):237-242.YIN J H,ZHANG P,GONG QF,et al.Sequence analysis of the internal transcribed sapcer of gene coding for rDNA inRussula subnigricansandR.nigricans[J].Mycosystema,2008,27(2):237-242.(in Chinese)

[7]Wasser S P.Medicinal mushroom science:history,current status,future trends,and unsolved problems[A].Proceedings of the 5th International Medicinal Mushroom Conference[C].Nantong:2009,6-9.

[8]Cho I H,Choi H K,Kim Y S.Difference in the volatile composition of pine-mushroom(Tricholoma matsutakeSing.)according to their grades[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54:4820-4825.

[9]2008年我國食、藥用菌產品出口全球的數(shù)量統(tǒng)計[J].浙江食用菌,2009,17:8.

[10]Chang ST.Medicinal mushroom products:nutriceuticals and/or pharmaceutics[A].Proceedings of the 5th International Medicinal Mushroom Conference[C].Nantong:2009,3-12.

[11]Huang J S,Chang H C,Li E,et al.Enhancement of hepatoprotective efficacy ofA ntrodia camphorataby Chinese tradition medicine[J].Journal of G astroenterology and Hepatology,2006,21(Suppl 2),A234.

[12]楊海龍,唐華.中藥對藥用真菌深層發(fā)酵的影響[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2009,35:128-131.YANG H L,TANG H.Effects of Chinese medicines on submerged culture of medicinal fungi[J].Food and Fermentation Industries,2009,35:128-131.(in Chinese)

[13]莊毅,潘揚,謝小梅,等.藥用真菌“雙向發(fā)酵”的起源、發(fā)展及其優(yōu)勢與潛力[J].中國食用菌,2007,26:3-6.ZHUANG Yi,PAN Yang,XIE Xiao-mei,et al.The origin,development and its advantage and potential of"the bi-directional solid fermentation"for medicinal fungi[J].Edible Fungi of China,2007,26:3-6.(in Chinese)

[14]Liu G Q,Zhang K C.Enhancement of polysaccharides production inGanoderma lucidumby the addition of ethyl acetate extracts fromEupolyphaga sinensisandCatharsius molossus[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2007,74:572-577.