大腸桿菌耐藥機制的研究進展

（河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院, 河南鄭州 450002）

致病性大腸桿菌是人類和動物臨床上最常見的病原之一，是威脅人類和動物健康的重要致病菌，也是近年來食品衛(wèi)生、給水衛(wèi)生及流行病學領域最重要的研究對象之一。在獸醫(yī)上，它一年四季均可發(fā)病，雞、鵝的發(fā)病率約為l0%～69%，大腸桿菌有致病性的占10%～15%，死亡率為3.8%～72%，從河北、北京、天津地區(qū)發(fā)生仔豬黃、白痢的10個豬場分離60株大腸桿菌，其中致病性大腸桿菌55株，耐藥率較高的分別為鏈霉素(80%)、慶大霉素(53.3%)、氨芐青霉素(75%)、復方新諾明(86.7%)、痢茵凈(76.7%)，每一種新藥推廣應用，總是伴隨著耐藥菌株的出現(xiàn)，這給細菌性疾病的防治工作提出了更高的要求和難度?？股氐膹V泛持續(xù)和不當使用，導致大腸桿菌耐藥株的不斷增多，耐藥機制的不斷變遷，特別是大腸桿菌多重交叉耐藥株的大量出現(xiàn)，使人醫(yī)臨床和獸醫(yī)臨床對大腸桿菌病的治療變得十分困難，有時甚至找不到可治之藥。大腸桿菌的耐藥性問題已經(jīng)引起了國內(nèi)外醫(yī)藥界的廣泛重視。

一、病原菌對抗生素的耐藥現(xiàn)狀

自1929年弗來明發(fā)現(xiàn)青霉素以來，伴隨著抗生素和化學抗菌劑的開發(fā)使用，各種病原菌對抗菌藥物的耐藥也日趨嚴重。有文獻報道，20世紀90年代后期，獸醫(yī)臨床上抗菌素被廣泛、長期使用，20世紀90年代以前、20世紀90年代、20世紀90年代以后(雞、豬)耐藥菌株百分比分別為28.73%、43.19%、53.47%，說明大腸桿菌耐藥性逐漸增強。目前病原細菌對青霉素的耐藥率達88%以上，對慶大霉素耐藥率超過75%、對大多數(shù)喹諾酮類藥的耐藥率也達50%以上，對頭孢一代、二代的耐藥率為40%～65%。

二、細菌的耐藥性機制

據(jù)耐藥狀況，1994年遠東地區(qū)感染性疾病會議將細菌耐藥分為兩類：第一類，單類耐藥性，即因單耐藥因素，細菌對一類抗菌藥物的所有種類都耐藥。第二類，多重耐藥性，因質(zhì)粒和染色體介導的耐藥因素，細菌對多類抗菌藥物耐藥。據(jù)細菌耐藥性的起源，又可將其分為：⑴固有耐藥性，即耐藥性的產(chǎn)生并不依賴于抗菌藥物的存在，而是細菌細胞所固有的，與細菌的遺傳和進化密切相關。固有耐藥性是細菌穩(wěn)定的遺傳特性，它受細菌染色體DNA控制并且是同屬細菌的共同特征，固有耐藥性包括自發(fā)基因突變導致的耐藥性和細胞膜藥物外輸作用引起的耐藥性，如腸道陰性桿菌對青霉素的耐藥；綠膿桿菌對氨芐西林的耐藥；鏈球菌對慶大霉素的耐藥等；⑵獲得性耐藥性，是指細菌在抗菌藥物選擇性壓力存在下經(jīng)過基因突變，或細菌在生長過程中由于移動耐藥因子的轉(zhuǎn)移而獲得的一種表型。其中移動因子包括質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、整合子和噬菌體。獲得性耐藥性主要包括移動因子和抗菌藥壓力作用下引起基因突變所導致的耐藥性。抗生素耐藥可以通過各種機制產(chǎn)生，包括結(jié)合靶物的失敗，對藥物靶物的過度表達，藥物的修飾和衰減，滲透屏障的產(chǎn)生或藥物外輸?shù)募せ?。包括以下幾個方面。

（一）改變靶位蛋白抗生素作用位點的改變或藥物作用表位的過度表達。抗生素作用位點的改變可能是大腸桿菌對某一類具有相同或相似結(jié)構抗生素耐藥的最主要因素，例如氟喹諾酮類藥物作用位點一編碼旋轉(zhuǎn)酶的gyrA、gyrB基因、編碼拓撲異構酶Ⅳ的parC、parE基因的點突變是大腸桿菌對喹諾酮類耐藥的最主要原因。

（二）產(chǎn)生滅活酶酶對抗生素的修飾和破壞是大腸桿菌常見的耐藥機理之一。包括β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷修飾酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶(耐氯霉素)和酯酶(耐大環(huán)內(nèi)酯類)。

（三）改變外膜通透性減少抗菌藥物進入菌體,減少抗生素向大腸桿菌內(nèi)的攝人而引起的大腸桿菌的耐藥。近年來的研究表明，大腸桿菌的外膜在耐藥過程中起著重要的作用。大腸桿菌的外膜對許多抗菌藥物的通透性較低，形成一道天然的屏障，阻礙抗菌藥物進人菌體細胞內(nèi)發(fā)揮抗菌作用。然而大腸桿菌外膜上存在的多種外膜蛋白質(zhì)，卻對大多數(shù)疏水性藥物具有良好的通透性。大腸桿菌外膜的孔蛋白主要OmpA、OmpF、OmpC， 據(jù) 報 導OmpF數(shù)量減少可以使細胞膜對抗生素的通透性下降，造成細菌對多種抗生素的敏感性下降，OmpF在保持細菌外膜正常通透性中起著重要作用。顯然這些膜孔蛋白的表達水平的變化可對細菌的耐藥性產(chǎn)生響。例如，許多抗菌藥物如β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素、氨基糖苷類、親水的氟喹諾酮類藥物均主要通過大腸桿菌外膜孔蛋(OmpF和OmpC，主要是OmpF)進入細胞內(nèi)發(fā)揮抗菌作用。然而，膜通透性的改變只能引起大腸桿菌低程度的耐藥，多重耐藥主要與主動外排系統(tǒng)有關。

（四）藥物外輸作用引起的耐藥性藥物外輸作用是微生物對藥物產(chǎn)生耐藥性的一個很重要機制，它是由藥物外輸泵(主動外輸系統(tǒng))來完成的。藥物外輸泵是一類位于細胞膜上的具有特殊結(jié)構的膜轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)，其作用機理為當細胞內(nèi)的藥物濃度聚集達到一定數(shù)值時，藥物外輸泵系統(tǒng)相關mRNA的表達增加，結(jié)果使細胞膜上外輸泵的數(shù)量增加，使細胞內(nèi)的藥物被泵出。外輸作用機制引起的耐藥性首先是2O世紀7O年代初在對四環(huán)素的耐藥性研究中報道的，其后包括喹喏酮類藥物在內(nèi)的一系列抗菌藥針對多種細菌的耐藥性研究陸續(xù)報道，一些外輸作用決定子也被克隆并進行了序列測定。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種藥物外輸系統(tǒng)，目前為止根據(jù)氨基酸序列的同源性將其分為五個超家族：MF (major facilitator)家族，SMR(small multi—drug resistance) 家族，RND(resistance nodulation cell division)家 族，ABC (ATP binding cassette)家族和MATE(multi—drug and toxic compound extrusion)超家族。革蘭氏陽性和陰性細菌的細胞膜外蛋白l7種全序列和2種部分序列組成同源膜融合蛋白家族(MFP)。每一種蛋白功能均和ATP結(jié)合盒家族、主易化家族、重金屬耐藥／小結(jié)節(jié)／細胞分裂家族的促進轉(zhuǎn)運蛋白、肽、藥物和碳水化合物通過革蘭氏陰性菌的細胞雙層膜的細胞膜轉(zhuǎn)運有關。MF家族的膜轉(zhuǎn)運有l(wèi)2～l4種膜轉(zhuǎn)運蛋白如：Bcr(大腸埃希氏菌)，EmrB(大腸埃希氏菌)、EmrD (大腸埃希氏 菌 )、MdfA ／ Cmr(大 腸 埃 希氏菌)、NorA (沙門氏菌)、QacA(金黃色葡萄球菌)和Bmr(枯草芽孢桿菌)和它們這些不同特點的藥物輸出系統(tǒng)媒介。SMR家族更準確的說有四種膜轉(zhuǎn)運區(qū)SMR (或QacC)(沙門氏菌)、QacE(產(chǎn)氣克雷伯氏菌)和EmrE(大腸埃希氏菌)。EmrE似乎和大環(huán)內(nèi)酯類組成一個有機體，更象是一個三聚物。這個家族的一些蛋白功能是作為一個低寡聚物。RND家族通常作為比進入周質(zhì)更直接的主動排出物質(zhì)的三組外輸系統(tǒng)組合。此外，內(nèi)膜RND轉(zhuǎn)運基因包含膜融合蛋白(MFP)和一種外輸膜因子(OMF)。大腸桿菌AcrA—AcrB-TolC、EmrA T0lc兩系統(tǒng)和MexA—MexB-OprM(沙門氏菌)是三重外輸系統(tǒng)，AcrB和MexB是RND轉(zhuǎn)運基因，AcrA和MexA是MFPs，TolC和OprM 是OMFs。一種電化學H+跨膜梯度是MF，SMR和RND家族藥物轉(zhuǎn)運排出的動力。ABC家族利用ATP作為能量來源。LmrA (乳酸乳球菌)和MsrA (沙門氏菌)是MATE家族的轉(zhuǎn)運因子，有l(wèi)2預計的片段和MF家族相似。然而MATE家族轉(zhuǎn)運因子和MF家族的任何膜并不表現(xiàn)特殊的序列相似性．NorM (弧菌屬)是這個家族的成員。NorM 似乎和Na 主動外排有關。外輸系統(tǒng)的作用底物總的可以包括抗菌藥、染料、消毒劑、洗滌劑、有機溶劑、親脂陽離子、脂類、抗微生物多肽類、化學藥物等。外輸系統(tǒng)可能是在細菌進化過程中形成的一種細胞自身解毒系統(tǒng)。在細菌基因組中，一般都存在外輸系統(tǒng)的調(diào)節(jié)基因。增強外流使進入菌體內(nèi)的抗菌藥物迅速外流，藥物從大腸桿菌主動外排的增加引起大腸桿菌的多重耐藥。大腸桿菌的耐藥性可以是固有的，也可以通過基因突變、基因轉(zhuǎn)移的過程而獲得大腸桿菌的獲得性耐藥可包括以上四類，對一種抗生素常具有一種以上的耐藥機理。

（五） 細菌生物被膜的形成細菌生物被膜是指細菌粘附于固體或有機腔道表面，形成菌落，并分泌細胞外多糖蛋白復合物將自身包裹其中而形成的膜狀物。細菌間的多糖蛋白復合物形成孔道維持細菌物質(zhì)代謝。常見的形成細菌生物被膜的臨床致病菌有銅綠假單胞菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌等。細菌形成生物被膜后，往往對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥性，其原因有：⑴細菌生物被膜可減少抗菌藥物滲透。⑵吸附抗菌藥物鈍化酶，促進抗菌藥物水解。⑶細菌生物被膜下細菌代謝低下，對抗菌藥物不敏感。⑷生物被膜的存在阻止了機體對細菌的免疫力，產(chǎn)生免疫逃逸現(xiàn)象，減弱機體免疫力與抗菌藥物的協(xié)同殺菌作用．針對外排泵介導耐藥性治療措施隨著抗菌藥物的廣泛應用，細菌耐藥性越來越嚴重，而且有明顯上升趨勢，給臨床治療造成極大困難。抗菌藥物發(fā)現(xiàn)和應用的早期，幾乎所有的細菌感染性疾病，只要使用一種抗菌藥物就能夠容易的治愈這些病。但是，這種樂觀的局面由于耐藥菌的出現(xiàn)而很快被改變。大多數(shù)耐藥菌開始時對抗感染藥物是敏感的，但長期使用抗菌藥物的環(huán)境使得耐藥菌得以選擇性的發(fā)展，或通過染色體的改變，或通過耐藥質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移所獲得的多種耐藥機制，嚴重影響了臨床抗感染治療的效果。

三、大腸桿菌耐藥抑制劑

大腸桿菌已形成對多種抗菌藥物耐藥的多種耐藥，解決大腸桿菌的耐藥性問題已經(jīng)刻不容緩。有如下4種方法有望解決大腸桿菌的耐藥性問題。

（一） 減少抗菌藥物的使用并保護現(xiàn)有的藥物通過對醫(yī)務工作者和公眾的教育，通過他們間的合作，對于能用簡單的控制方法解決的就不用抗菌藥物進行治療(如適當?shù)南词?，獸醫(yī)臨床上注意飼料、飲水及飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生等)。

（二） 開發(fā)新的抗菌藥物膜通透性較好的抗菌藥物，使得藥物內(nèi)流速度大于藥物被外排的速度，保證菌株對該抗生素敏感性。但開發(fā)一個新的抗菌藥物需要l0年，花費幾億英鎊，但隨著耐藥機制的不斷變遷，新藥的應用周期被無形中縮短。現(xiàn)在有幾種藥物正在開發(fā)中噁唑烷酮類和晚霉素類是兩種完全新型的藥物。另外還有奎奴普?。_福普汀，甘氨酰環(huán)素類以及新的氟喹諾酮類、糖肽類和碳青霉素類藥物等。

（三） 研制大腸桿菌多重耐藥抑制劑大腸桿菌的AcrAB泵可介導多種藥物的外輸，如果使該系統(tǒng)失活，大腸桿菌即從多重耐藥狀態(tài)變?yōu)橄鄬γ舾袪顟B(tài)，因而研制出的有效抑制劑能在相當程度上克服其耐藥性。

第一類，大腸桿菌E．coli的RND-type轉(zhuǎn)運子的抑制劑——MG2O7，l10 (苯 丙 氨 酸-精 氨酸-β-萘胺)，是一種競爭性外排蛋白抑制劑，具二肽酰胺結(jié)構的小分子化合物，可顯著抑制臨床常見的具多重耐藥外排泵的銅綠假單胞菌、金色葡萄球菌、腸球菌、革蘭陰性菌等耐藥菌。該化合物本身無抑菌作用，其MIC>256μg /ml，但與氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯、β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合運用可顯著提高耐藥菌的敏感性．與抗真菌藥氟康唑、依康唑及特奈芬等聯(lián)合運用也可增加對因外排泵機制耐藥的白念珠菌的作用。

第二類，l-(1-Naphthylmethy1)-piperazine是MDR家族逆轉(zhuǎn)機制的外輸泵抑制劑：砷酸鹽；Phe-Argβ-naphthylamide(PAIβN)或 其 它N-雜環(huán)有機復合物如：1-(4-萘基丁基)-哌嗪(PBP)；l-(1-萘基)哌嗪(PP)，l-(1-萘甲叉)-哌嗪(NMP)，和1-[4-(2-萘基)丁基]-哌嗪；l-(3-三氟甲噻嗪)-哌嗪(mTFMPP)等大多都是未取代的芳基哌嗪。

（四）開發(fā)不使用抗菌藥物治療感染的治療策略針對主動外排系統(tǒng)能量來源制劑如DNP (2，4二硝基酚)或間一氯苯羰氰化物(CCCP)，檢查藥物攝取率增加與否測得。該過程通過去偶聯(lián)作用使膜兩側(cè)的能量梯度消失或能量被抑制，藥物不可能被泵出，表現(xiàn)為藥物攝取率增加。事實上，僅在毫摩爾濃度下有效能量抑制劑CCCP能增加細胞對氟喹諾酮類藥物的攝取量。通過信號標記誘導的大量突變及障礙碼分辨系統(tǒng)開發(fā)的對這些高度特異靶位的藥物比傳統(tǒng)的抗菌藥物具有更窄的作用譜；構建的工程DNA質(zhì)?？梢云茐牟≡鷾缁羁咕幬锏幕蚝推茐呢撠煻玖Φ幕虻难芯抗ぷ髡谶M行中。

總之，大腸桿菌和其他病原菌一樣對抗菌藥物的耐藥性是一個復雜的、持續(xù)進化的問題，耐藥性問題的解決是一項非常艱巨的任務。