甜菜堿的產(chǎn)品控制及含量測(cè)定

周歷嵐

甜菜堿（Betaine）是一種能為動(dòng)物提供高效活性甲基的類維生素的營養(yǎng)添加劑，最早發(fā)現(xiàn)于19世紀(jì)的歐州，因它主要存在于甜菜的糖蜜中，故而得名。甜菜堿的化學(xué)名稱是1-羧基-N,N,N-三甲基乙內(nèi)脂，分子式為C5H11NO2，化學(xué)結(jié)構(gòu)與甘氨酸類似，屬于季胺堿類。

甜菜堿具有多種功能，作為高效甲基的供體，可以促進(jìn)動(dòng)物脂肪代謝，緩和應(yīng)激，調(diào)節(jié)滲透壓，促進(jìn)家禽生長(zhǎng)，增加體重及產(chǎn)蛋量，穩(wěn)定維生素，預(yù)防球蟲病，提高瘦肉率，防止脂肪肝，提高飼料利用率等多種功效。最近幾年，隨著生物制藥技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們又發(fā)現(xiàn)甜菜堿在生物發(fā)酵中起著重要作用，在發(fā)酵中添加適量甜菜堿可提供甲基供體，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，從而大大改善藥品的質(zhì)量并降低生產(chǎn)制造成本。是良好的飼料及食品添加劑。

目前市場(chǎng)上甜菜堿的種類很多，根據(jù)生產(chǎn)工藝不同分為天然甜菜堿、化工合成甜菜堿及其制劑。化學(xué)合成甜菜堿根據(jù)分子結(jié)構(gòu)不同可分為甜菜堿和甜菜堿鹽酸鹽；按產(chǎn)品功能和生產(chǎn)工藝上可分為復(fù)合甜菜堿、吸附甜菜堿。甜菜堿純品為白色晶體，有甜味和特殊的蛋白質(zhì)味,易潮解,甜菜堿屬無毒物質(zhì)，其外觀因載體和生產(chǎn)工藝不同而有所差異。隨著市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)日益激烈，一些廠家受利益驅(qū)使，在甜菜堿中摻入低成本物質(zhì)，以獲取高額利潤。由于飼料廠家檢測(cè)手段的缺乏，不能檢測(cè)出甜菜堿的真實(shí)含量，給飼料廠家和養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重后果。筆者根據(jù)多年工作實(shí)踐，下面就幾種不同類型甜菜堿品質(zhì)控制要點(diǎn)和甜菜堿含量的檢測(cè)方法分別進(jìn)行介紹和探討。

1 不同形式甜菜堿產(chǎn)品的控制要點(diǎn)

1.1 天然甜菜堿

天然甜菜堿取自于甜菜制糖廢液，一般是用離子交換提取和離子排斥提取分離加工而成。按《天然甜菜堿GB/T21515—2008》(以下簡(jiǎn)稱GB/T21515)規(guī)定的技術(shù)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)和品控即可達(dá)到產(chǎn)品質(zhì)量的要求。

1.2 化工合成甜菜堿

1.2.1 甜菜堿、復(fù)合甜菜堿、吸附甜菜堿

化工合成甜菜堿是用三甲胺與氯乙酸鈉進(jìn)行反應(yīng)，然后用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑵浞蛛x從而得到甜菜堿產(chǎn)品。復(fù)合甜菜堿和吸附甜菜堿從生產(chǎn)工藝上均屬于化工合成甜菜堿，是與促甲基轉(zhuǎn)化物質(zhì)、營養(yǎng)增強(qiáng)劑、載體吸附或復(fù)合而成不同含量和劑型的產(chǎn)品。

因化工合成甜菜堿及其制劑還未見相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)出現(xiàn)，多以廠家企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為主。含量測(cè)定推薦采用《飼料中甜菜堿的測(cè)定——離子色譜法NY/T 1619—2008》（以下簡(jiǎn)稱NY/T 1619）（后于2009年12月1日升級(jí)為《飼料中甜菜堿的測(cè)定——離子色譜法GB/T 23710—2009》（以下簡(jiǎn)稱GB/T23710）進(jìn)行檢測(cè)。此外，含量標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)節(jié)也應(yīng)寫明，含量應(yīng)大于標(biāo)簽標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的含量，合同中如約定含量允許一定的檢測(cè)誤差，則最大誤差應(yīng)不大于測(cè)定方法允許誤差的兩倍。

1.2.2 鹽酸鹽甜菜堿

甜菜堿鹽酸鹽是用三甲胺與氯乙酸鈉進(jìn)行反應(yīng)后，進(jìn)行酸化處理，得到鹽酸鹽甜菜堿產(chǎn)品。目前執(zhí)行的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)是《飼料級(jí)甜菜堿鹽酸鹽NY 399—2000》(以下簡(jiǎn)稱NY399)。NY399因其含量檢測(cè)采用的是高氯酸非水滴定法，此法在檢定純品鹽酸鹽甜菜堿時(shí)非常有效和準(zhǔn)確，但如有摻假時(shí)，此法很難辯其真?zhèn)?。故此產(chǎn)品含量檢測(cè)需使用離子色譜GB/T23710，其它技術(shù)指標(biāo)按NY399要求控制即可達(dá)到品質(zhì)要求。

2 甜菜堿含量的測(cè)定

飼料企業(yè)對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量控制和檢測(cè)、評(píng)價(jià)甜菜堿在動(dòng)物體內(nèi)的生物利用率、代謝等方面的研究都需要對(duì)甜菜堿含量進(jìn)行有效的分析，以甜菜堿含量的高低來判斷含甜菜堿制劑的質(zhì)量，可作為控制產(chǎn)品質(zhì)量的一項(xiàng)客觀指標(biāo)。甜菜堿的檢測(cè)方法有酸堿滴定法、比色法、重量法、薄層掃描定量法、凱氏定氮法、高氯酸非水滴定法、分光光度法、氣相色譜法、離子色譜法等，在檢測(cè)甜菜堿時(shí)，可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)室條件和測(cè)定要求選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

2.1 酸堿滴定法

其原理是甜菜堿與雷氏鹽反應(yīng)生成的甜菜堿雷氏鹽沉淀溶解在70%丙酮中,與硝酸銀、硝酸鈉溶液反應(yīng)生成雷氏銀沉淀和硝酸甜菜堿,用氫氧化鈉滴定生成硝酸甜菜堿。根據(jù)氫氧化鈉消耗的量來換算甜菜堿的含量。

此法缺點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作比較復(fù)雜，檢測(cè)靈敏度較低，檢測(cè)誤差比高氯酸滴定法高。

2.2 比色法

其原理是甜菜堿在pH值為1時(shí)能和雷氏鹽生成紅色沉淀，將沉淀過濾洗凈后溶解在70%丙酮中，呈粉紅色溶液,利用其在波長(zhǎng)為525 nm處有最大吸光值的原理，在525 nm處測(cè)定吸光度,甜菜堿濃度在0.25～1.5 mg/ml時(shí)符合朗伯-比爾定律。檢測(cè)時(shí)需注意雷氏鹽要現(xiàn)配現(xiàn)用，加強(qiáng)對(duì)反應(yīng)溫度的控制，沙芯漏斗的選擇等關(guān)鍵性操作。

此法缺點(diǎn)是操作復(fù)雜，其結(jié)果容易受到飼料中含有的有機(jī)胺類物質(zhì)的影響。此法的優(yōu)點(diǎn)是具有一定鑒別含氮化合物的能力，檢測(cè)成本較低。

2.3 紫外分光光度法

此法應(yīng)用較早，將甜菜堿樣品與顯色劑發(fā)生顯色反應(yīng)而生成有色物質(zhì),使用分光光度計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定。樣品與冷卻的KI混合產(chǎn)生碘化物沉淀,離心后用二氯乙烷溶解沉淀,在波長(zhǎng)為365 nm處測(cè)定吸光度,通過工作曲線計(jì)算出甜菜堿含量。但該法干擾因素較多,特別是在測(cè)定低含量樣品時(shí)誤差較大。

2.4 重量法

在一定酸度(pH值2.0～6.5)溶液中,甜菜堿和四苯硼鈉生成白色沉淀,根據(jù)生成沉淀的量計(jì)算甜菜堿的含量。

此法重現(xiàn)性好，具有一定鑒別含氮化合物的能力，但不能排除其他可能的干擾物如氨基酸、六次甲基四胺，并且實(shí)驗(yàn)操作比較復(fù)雜，需注意四苯硼鈉試劑的低溫貯存、澄清度的處理等影響。

2.5 薄層掃描定量法

用0.5%羧甲基纖維素鈉的硅膠G薄層板，以氯仿-甲醇-甲酸-水為展開劑，以改良碘化鉍溶液為顯色劑，掃描波長(zhǎng)為520 nm,以甜菜堿含量進(jìn)行測(cè)定。

由于操作中難以保持展開溫度、展開劑極性及蒸氣壓等諸多條件的恒定,該法重現(xiàn)性并不是很理想。

2.6 凱氏定氮法

用凱氏定氮法消化測(cè)定樣品中的氮，通過甜菜堿和氮含量的換算公式得到甜菜堿的量。一般可做兩個(gè)測(cè)定：①檢測(cè)正常情況下的三甲胺和甜菜堿之和：水提取液消解，加堿蒸餾測(cè)定總N；②檢測(cè)正常情況下反映三甲胺的量：直接堿蒸餾測(cè)定氨態(tài)氮和一、二、三級(jí)胺。

此法的優(yōu)點(diǎn)可減少空氣污染對(duì)操作人員健康的危害，也可排除環(huán)境溫度、濕度的變化對(duì)高氯酸非水滴定法的影響。能排除氯離子對(duì)檢測(cè)的干擾，具有一定的鑒別能力，并且一般大型飼料廠均有全自動(dòng)定氮儀，不需購置儀器，操作較簡(jiǎn)單、快速，做大批量樣品更能顯示其優(yōu)越性。此法的缺點(diǎn)是在檢測(cè)純品時(shí)檢測(cè)誤差比高氯酸滴定法高，并且不能排除含氮物質(zhì)的干擾。

2.7 高氯酸滴定法

《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 2003》中《鹽酸甜菜堿》、NY 399、GB/T 21515分別是甜菜堿鹽酸鹽和甜菜堿產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，含量檢測(cè)采用高氯酸非水滴定法。該法是利用甜菜堿鹽酸鹽為季胺鹽類化合物，用冰醋酸為溶媒，與乙酸汞可形成難電離的氯化汞，并形成季銨醋酸鹽而具有明顯的堿性,以結(jié)晶紫為指示劑，用高氯酸進(jìn)行非水滴定。因市售的冰醋酸含有少量水分，為避免水分存在對(duì)滴定的影響，GB/T 21515反應(yīng)條件中還加入一定量的乙酸酐，使其與水反應(yīng)變成醋酸，有效確保在非水溶劑中進(jìn)行滴定分析，確保了結(jié)果的準(zhǔn)確。

優(yōu)點(diǎn)：①對(duì)于純品的甜菜堿、甜菜堿鹽酸鹽用該法檢測(cè)準(zhǔn)確、可靠。具有重現(xiàn)性好、精度高的優(yōu)點(diǎn)。②可利用此法確定甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)品的真實(shí)含量。

缺點(diǎn)：①該法采用結(jié)晶紫指示劑，終點(diǎn)顏色變化不明顯，較難判定終點(diǎn)；②采用的高氯酸和冰醋酸有很強(qiáng)的腐蝕性，冰醋酸還有刺鼻的味道，操作時(shí)要特別小心；③高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液放置過久會(huì)變成黃色，對(duì)化驗(yàn)室外部環(huán)境控制要求較高，受環(huán)境溫度、濕度影響較大，要經(jīng)常配制、標(biāo)定。④利用此法進(jìn)行檢測(cè)只要樣品中具有堿性基團(tuán)的化合物如胺類、氨基酸類、含氮雜環(huán)化合物、某些有機(jī)堿的鹽及弱酸鹽、鈉離子等，都會(huì)影響高氯酸非水滴定法檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

此法不適用于甜菜堿預(yù)混劑、復(fù)合甜菜堿的檢測(cè)。

2.8 離子色譜法

離子色譜法是20世紀(jì)70年代以來發(fā)展起來的一種分析離子的液相色譜法，甜菜堿（鹽酸鹽）屬于有機(jī)堿，在弱酸性陽離子交換柱上可以分離，而且可以與許多干擾物質(zhì)分離開，這樣可以有效的排除干擾，科學(xué)、準(zhǔn)確的測(cè)定飼料中的甜菜堿。

現(xiàn)在使用離子色譜法檢測(cè)甜菜堿的含量的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 21515，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)有《飼料中甜菜堿的測(cè)定——離子色譜法NY/T 1619—2008》（以下簡(jiǎn)稱NY/T 1619）、GB/T 23710。于2009年12月1日正式實(shí)施的GB/T 23710，除了適用范圍、標(biāo)準(zhǔn)品含量及試劑的配制上描述更加準(zhǔn)確外，操作方法上與NY/T 1619中離子色譜含量檢測(cè)基本一致，屬于從農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化為國家推薦標(biāo)準(zhǔn)。GB/T 21515中含量檢測(cè)使用的仲裁法和GB/T 23710的檢測(cè)方法都使用離子色譜法，下面從檢測(cè)實(shí)際談?wù)勥@兩種離子色譜檢測(cè)甜菜堿含量的主要區(qū)別。

2.8.1 適用范圍不同

因GB/T 21515和GB/T 23710都屬于國家推薦性標(biāo)準(zhǔn)，前者適用于從糖蜜廢液中提取加工而成的天然甜菜堿產(chǎn)品；后者適用于配合飼料、濃縮飼料、預(yù)混合飼料、飼料添加劑甜菜堿（或鹽酸鹽）和復(fù)合甜菜堿中甜菜堿（或鹽酸鹽）含量的測(cè)定。后者涵蓋范圍更廣。

2.8.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制不同

①GB/T 21515規(guī)定一水甜菜堿需使用（140±2）℃烘干18 h的標(biāo)準(zhǔn)品0.10 g。GB/T 23710規(guī)定于105℃干燥甜菜堿0.1000 g(或0.1312 g于105℃干燥過的甜菜堿鹽酸鹽)。

②標(biāo)準(zhǔn)品賦值：因目前甜菜堿沒有由國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心標(biāo)定過的標(biāo)準(zhǔn)品出售，市場(chǎng)上所售的均是含量大于98%的分析純或優(yōu)級(jí)純的試劑，在化驗(yàn)室操作經(jīng)驗(yàn)上，我們可利用高氯酸非水滴定法測(cè)定純品甜菜堿含量極為準(zhǔn)確的特點(diǎn)，對(duì)優(yōu)級(jí)純或分析純的試劑進(jìn)行賦值后代入計(jì)算，最終檢測(cè)結(jié)果將更加準(zhǔn)確。

2.8.3 色譜條件的選擇

色譜條件的選擇上GB/T 21515使用3.0 mmol/l甲烷磺酸做流動(dòng)相，GB/T23710使用1.5 mmol/l甲磺酸水溶液做為流動(dòng)相。甲磺酸作為流動(dòng)相，具有更好的穩(wěn)定性和低的基線噪音。不同濃度的甲磺酸做流動(dòng)相，在確保分析柱壽命的前提下，應(yīng)盡量使用低濃度的淋洗液，選擇1.5 mmol/l甲磺酸水溶液做流動(dòng)相，既可以保證保留組分與試劑峰及其它組分的良好分離，又可以保證分析柱的壽命。但是在這個(gè)條件下，飼料中的某些成分如鎂、鈣等保留時(shí)間較長(zhǎng)，因此，要使運(yùn)行時(shí)間延長(zhǎng)，確?；€恢復(fù)。

2.8.4 提取劑和提取方式的選擇

①樣品處理不同：GB/T 21515樣品需先在105℃烘箱干燥至恒重，而GB/T 23710樣品不需烘至恒重而是直接稱量，這種樣品稱量方式的差異導(dǎo)致兩種檢測(cè)方法結(jié)果會(huì)存在一定的差異。如不先經(jīng)過干燥，甜菜堿系列產(chǎn)品易發(fā)生吸潮的現(xiàn)象，有可能出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)。

②提取方式：兩方法均使用了水作為提取劑，許多文獻(xiàn)報(bào)道，提取甜菜堿使用水、稀鹽酸或有機(jī)溶劑作提取劑，用純品甜菜堿和樣品分別試驗(yàn)，結(jié)果表明：用稀鹽酸作提取劑時(shí)，試劑峰大，基線情況不好，用水作提取劑，通過添加回收率試驗(yàn)證明，提取完全。

GB/T 23710在樣品處理時(shí)較GB/T 21515增加了在振蕩器或超聲波提取30 min的步驟，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，兩種方法提取效果無差異，可由實(shí)驗(yàn)室條件選擇。

③樣品凈化上的差異：飼料樣品用水提取后，提取液中會(huì)有來自飼料的脂肪和蛋白，造成基線改變和污染分析柱，GB/T 23710加入了三氯甲烷萃取凈化，并劇烈震搖放置10 min，離心10 min,取上清液,過膜處理，使樣品達(dá)到了很好的純化效果。

2.8.5 允許差表述方法的差異

GB/T 21515允許差是以算術(shù)平均值為測(cè)定結(jié)果，兩次平行測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不大于這兩個(gè)測(cè)定值的算術(shù)平均值的3%。GB/T 23710的重復(fù)性為兩個(gè)平行試驗(yàn)的相對(duì)偏差不大于5%。

用離子色譜進(jìn)行檢測(cè)時(shí)需注意對(duì)色譜儀、色譜柱和抑制器的維護(hù)，關(guān)注標(biāo)準(zhǔn)溶液的保存期，注意峰面積的變化。用離子色譜法測(cè)定時(shí)誤差較大，如果譜圖無誤，可用凱氏定氮法進(jìn)行對(duì)比。離子色譜法的檢出限量均為0.02%。標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23710對(duì)樣品前處理方法和儀器分析條件進(jìn)行了系統(tǒng)的優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)也發(fā)現(xiàn)：含量小于0.02%時(shí)，樣品峰小于3倍噪音量，且測(cè)定回收率超差，平行樣品測(cè)定結(jié)果偏差大。而含量大于0.02%時(shí)，可以得到較好的回收率及較小的變異。該法準(zhǔn)確、快速。再現(xiàn)性高、可連續(xù)進(jìn)樣，能滿足大量樣本進(jìn)行分析時(shí)快速檢測(cè)的要求。

此外氣相層析法、質(zhì)譜法等微量測(cè)定方法識(shí)假能力強(qiáng)，定性準(zhǔn)確性高，也能同時(shí)定量。但儀器價(jià)格昂貴，操作要求高，檢測(cè)誤差大。

目前，《飼料中甜菜堿的測(cè)定 離子色譜法 GB/T 23710—2009》作為國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)最新頒布的仲裁執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，抗干擾能力強(qiáng)，能有效去除大部分干擾物質(zhì)對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響，并能同時(shí)測(cè)定甜菜堿中鈉離子、鎂離子、鈣離子、游離銨和三甲胺的含量，這無論是對(duì)控制甜菜堿產(chǎn)品質(zhì)量還是為飼料養(yǎng)殖企業(yè)提供科學(xué)配方，都具有十分重要的指導(dǎo)作用，雖然GB/T 23710已經(jīng)涵蓋了所有甜菜堿系列的所有產(chǎn)品含量檢測(cè)，但由于離子色譜價(jià)格較高，維護(hù)成本較高，檢測(cè)誤差比高氯酸滴定法高的缺點(diǎn)，離子色譜法在飼料企業(yè)不易普及，故檢測(cè)甜菜堿時(shí)，如確定為純品的甜菜堿，可選擇高氯酸非水滴定法，也可根據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件和測(cè)定要求選擇適當(dāng)?shù)姆椒?，從而有效確保甜菜堿及其制劑的質(zhì)量。