禽支原體病最新診斷標(biāo)準(zhǔn)

奚德華，羅堅強，王姣

（常州市動物疫病預(yù)防控制中心，江蘇常州 213015）

雞毒支原體（MG）和滑液支原體（MS）屬于柔膜體綱，支原體目，支原體科。雖然火雞支原體和衣阿華支原體也可以引起家禽的疾病，但MG和MS是致病支原體中最重要的，并且在全球廣泛傳播。

MG感染在雞和火雞中十分重要，會造成呼吸系統(tǒng)疾病、肉蛋產(chǎn)量減少。它也會造成禽的上呼吸道病。最近在北美發(fā)現(xiàn)，MG會引起家雀結(jié)膜炎。在家禽中，MG感染可通過種蛋垂直傳播，也可通過密切接觸水平傳播，環(huán)境樣品中可鑒定出MG特異性核苷酸。目前尚未證實有其它傳播方式。

MG和MS感染的確診手段主要有：分離培養(yǎng)、血清學(xué)方法或從感染組織/棉拭子樣品中檢測DNA。盡管疑似樣品可以接種雞胚或雞，但由于結(jié)果不可靠，常需要重復(fù)采樣診斷。

一、病原鑒定

（一）臨床鑒別診斷及樣品采集MG感染的臨床癥狀常表現(xiàn)為亞臨床到明顯的呼吸道癥狀，包括鼻炎、結(jié)膜炎、咳嗽和噴嚏，有時會出現(xiàn)鼻腔分泌物，音和張口呼吸。嚴(yán)重時出現(xiàn)眶下竇腫脹以致眼瞼閉合，一側(cè)或兩側(cè)鼻竇炎也是特征之一。這一癥狀在火雞和賽禽中尤為突出。在火雞和賽禽中，還伴有泡沫狀眼部分泌物的結(jié)膜炎特征（雞偶有出現(xiàn)）。為了去除眼部分泌物，火雞常造成翅羽及傷口污染。除了結(jié)膜炎，感染的家雀還會表現(xiàn)出眼部和鼻腔分泌物和眼瞼腫脹的癥狀。雞毒支原體可能與雞和火雞的急性呼吸道病有關(guān)，特別是幼禽和火雞更易感。一些病毒如新城疫、傳染性支氣管炎和一些細(xì)菌病如大腸桿菌的繼發(fā)感染在很大程度上影響了疾病的嚴(yán)重性。在火雞中，禽肺病毒與支原體有協(xié)同作用，會引起長期的慢性病及種雞和蛋雞的產(chǎn)蛋減少。最初出現(xiàn)的呼吸道病變是粘液性滲出液，隨后出現(xiàn)卡他樣和干酪樣滲出物，這些滲出物可能會在氣囊中形成纖維素樣滲出，形如塊狀。在火雞和賽禽腫脹的眶下竇中包含粘液樣至干酪樣滲出物。

雞MG或MS感染常與其它一些病原，如新城疫的弱毒株和雞傳染性支氣管炎所引起的呼吸系統(tǒng)疾病混淆。這些病原常與MG或MS混合感染，而禽副嗜血桿菌和多殺巴氏桿菌則不能。在火雞中，MG感染常與禽肺病毒感染混淆，而出現(xiàn)氣囊炎這一典型癥狀亦并非MG感染特有，在大腸桿菌、多殺巴氏桿菌、衣原體或MS也能發(fā)生這樣的病變。MS能引發(fā)的傳染性滑液囊炎，在鑒別診斷時，要與金黃色葡萄球菌感染和呼腸孤病毒引起的感染性腱鞘炎相區(qū)別。

感染滑液囊支原體的雞常表現(xiàn)雞冠蒼白，跛行和生長緩慢，關(guān)節(jié)腫脹，常見含大量尿酸鹽的綠色糞便。關(guān)節(jié)和腱鞘處可見粘稠的乳白至灰色滲出物，肝脾腫大，腎腫大，有花斑。呼吸道癥狀和病變與MG類似，只是MS表現(xiàn)輕微些。和MG一樣，MS也與其它呼吸道致病因子有協(xié)同作用。MS不同毒株之間在毒力和組織嗜性上差異極大。

從活鳥、活禽或新鮮凍存的禽肉產(chǎn)品。對于活禽，采集鼻腔、口咽、食道、氣管、眼、泄殖腔棉拭子樣品；對于死禽，則采集鼻腔、眶下竇、氣管或氣囊等部位樣品，分泌物可由眶下竇和關(guān)節(jié)腔中吸取。臨床樣品可通過從死胚或破殼但未孵化成功的雛雞體內(nèi)采集，可從胚胎的卵黃膜內(nèi)表面、口咽和氣囊獲得。

（二）病原分離和培養(yǎng)在采集后，所有待檢樣品需盡快進(jìn)行檢測。在運輸過程中，最佳方式是將小片組織置于支原體肉湯中，而棉拭子則在1～2 ml支原體肉湯中劇烈振蕩后棄去?？梢詫⒚奘米咏萦谥гw肉湯中，隨后再用于樣品采集。在運輸過程中，需加冰袋或者其它制冷措施保持低溫狀態(tài)，因為MG和MS在室溫下很快就會死亡。在支原體肉湯中，樣品需要進(jìn)行倍比稀釋，因為組織中常存在特異的抗體、抗生素或抑制因子，可能抑制支原體增殖。

目前已有幾種用于分離培養(yǎng)的培養(yǎng)基，可通過Mycoplasma Experience、Reigate、Surrey 或United Kingdom購買。支原體培養(yǎng)基通常含有蛋白質(zhì)消化液和肉浸液基礎(chǔ)，需要添加血清或血清組分、酵母提取液、葡萄糖和細(xì)菌抑制劑。非常重要的一點是：每一批新的培養(yǎng)基都需要通過最近分離的體外低傳代MG分離株進(jìn)行測試，因為一些組分，特別是酵母提取液和血清批次差異很大。

（三）生物學(xué)鑒定生化反應(yīng)（如發(fā)酵葡萄糖、不水解精氨酸）可以幫助鑒定，但這不是MG或MS特有的，也不是克隆純化所必需的。

免疫學(xué)和DNA檢測方法可以用來鑒定支原體分離株，包括間接熒光抗體技術(shù)（IFA）和免疫過氧化物酶檢測法（IP），這兩種方法簡易、敏感度高且特異性強。檢測方法還包括生長抑制檢測（GI）和代謝抑制檢測（MI）。純化（克?。┡囵B(yǎng)物對GI和MI檢測技術(shù)而言是必須的，但對IFA和IP檢測則不是。IFA和IP可以檢測不止一種支原體的存在，而只有特異性血清才會與相應(yīng)的純化克隆起反應(yīng)，而其它則不反應(yīng)。然而，在鴨、鵝和一些野生鳥類體內(nèi)常會分離到模仿支原體，與MG有相同的生化特征，與MG有血清學(xué)交叉反應(yīng)。該支原體可按Kempf等建立的PCR-RFLP（多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)/限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性）診斷法，將其與MG相區(qū)分。抑或者用MG和模仿支原體的單菌落做平行試驗，對連續(xù)稀釋的抗血清做免疫熒光檢測，這要求抗血清要有較高的滴定才行。

上述方法并不能確診，還需接種雞胚或動物接種法進(jìn)行細(xì)致鑒定，但這耗時耗力，因而現(xiàn)在逐漸被PCR技術(shù)所取代。就像在人工培養(yǎng)基中一樣，支原體也可在雞胚中增殖，具體做法是：將它們接種于不含醋酸亞鉈的肉湯中，37℃培養(yǎng)30～60 min，然后取0.05～0.1 ml量接種6～8日齡無支原體感染雞胚的卵黃囊，每天照胚，若雞胚在24 h內(nèi)死亡則棄去，超過24 h死亡的雞胚都冷凍至培養(yǎng)結(jié)束，超過5 d仍未死亡的雞胚可以放于4℃冰箱4 h使其死亡以減少收胚時的出血。收集卵黃液在肉湯或固體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。卵黃液形成的菌落可能并不清晰，因此需要劃線使卵黃變薄或初次在接種支原體肉湯培養(yǎng)時將卵黃稀釋，以獲得更好的效果。

動物接種法是將可疑組織的勻漿液接種4只8～16周齡對支原體易感的無支原體感染的SPF雞。如果這些雞體內(nèi)存在支原體，能證實其DNA或/和存在特異性抗體，才能確診。

二、免疫學(xué)方法

免疫熒光和IP法對實驗室分離株是普遍適用的診斷方法，而不直接適用于感染滲出液和感染組織，這是因為支原體體積太小，在光學(xué)顯微鏡下無法鑒別，而且相應(yīng)的陽性和陰性對照滲出液/組織不容易獲得。

（一）間接熒光抗體試驗(IFA)IFA試驗的推薦方法。這一方法適用于鑒定在瓊脂板上長出明顯菌落的支原體，步驟簡述如下：①從長有菌落的瓊脂板上，切下1.0 cm×0.5 cm大小的一塊，菌落向上放置在標(biāo)記過的載玻片上；②為了避免以后弄錯方向，在樣品塊的右下角切下一塊作為標(biāo)記。在一個載玻片上放置一塊未知的分離株、一塊MG培養(yǎng)物、一塊MS培養(yǎng)物以及另外一個不同種的已知支原體培養(yǎng)物。另一個載玻片上放置一塊未知的分離株；③在第一個載玻片上的每個樣品塊表面滴加一滴適當(dāng)稀釋度的MG（或MS）抗血清，在第二個載玻片上的樣品塊上滴加正常兔血清；④所有樣品塊放在濕盒中室溫孵育30 min；⑤將每一個樣品塊分別放入一個標(biāo)記好的含有PBS（pH7.2）的指形管中，在渦旋振蕩器上洗洗2次，每次10 min，最后再把樣品塊放回相應(yīng)的載玻片上；⑥吸去載玻片上樣品塊的多余水分，在每個樣品塊上滴加一滴適當(dāng)稀釋的FITC標(biāo)記二抗，同前孵育及洗滌；⑦將樣品塊放回相應(yīng)原來的載玻片上，然后用熒光顯微鏡檢測菌落熒光。這個結(jié)果的判定是主觀的，需要一定的專業(yè)知識。與對照進(jìn)行比對是必需的，并且這些對照必須是預(yù)期的反應(yīng)。一些實驗室也使用直接熒光法（DFA）進(jìn)行檢測，即利用熒光素標(biāo)記抗血清。在DFA試驗中使用比較廣泛的一種技術(shù)是，在支原體瓊脂平板上放置一個不銹鋼圓筒，里面不間斷的提供試劑。雖然操作快速簡單，但是所獲得結(jié)果的特異性比間接方法要低，因此還是首選間接熒光法。

（二）間接免疫過氧化物酶檢測法(IP)此方法的原理與IFA試驗相似，只是特異性抗體與菌落的原位結(jié)合通過添加過氧化物酶標(biāo)記的抗兔免疫球蛋白來檢測。陽性對照為相應(yīng)的底物，氧化后可以產(chǎn)生有色菌落。

這樣的免疫結(jié)合過程也可以先將菌落印跡在NC膜上，然后用類似的方法進(jìn)行反應(yīng)。和IFA試驗一樣，IP試驗可使用多抗血清來進(jìn)行分離株的血清分型。IP試驗超越免疫熒光方法的優(yōu)點在于IP試驗不需要昂貴的熒光顯微鏡。

（三）生長抑制試驗(GI)在GI試驗中，支原體的生長被特異性抗血清所抑制，從而可以進(jìn)行種類鑒定。相對來說，此方法不太敏感，所用血清必須高效價、單一特異性，并且在哺乳動物宿主體內(nèi)制備，因為禽類血清常常不能有效抑制支原體的生長。試驗中的支原體必須是純培養(yǎng)物，并且應(yīng)當(dāng)檢測數(shù)個稀釋度，以104CFU/ml的濃度最合適。支原體的生長率會嚴(yán)重影響實驗結(jié)果，先27℃培養(yǎng)24 h，然后再在37℃培養(yǎng)，則會使生長受到阻礙。

三、核酸檢測法

常規(guī)培養(yǎng)和檢測的另一種方法是使用特異DNA檢測法。MG或MS可以用DNA雜交探針來檢測，但是現(xiàn)在更常用的是用PCR來擴增檢測材料中一段特殊的DNA片段。目前至少有一種商品化的MG DNA試劑盒，可以用棉拭子提取物直接進(jìn)行PCR鑒定。分子生物學(xué)方法也可有效用于區(qū)別MG和MS株，但是迄今為止，這些方法只能在專門的實驗室進(jìn)行。一種快速精確的方法是：DNA指紋印跡圖譜技術(shù)，即利用隨機引物PCR或隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD），該方法可復(fù)制性好，使用的PCR引物是隨機的，且長度較短，快速易行，被證實對MG流行病學(xué)調(diào)查十分有效。但是，該方法要求不同菌株必須在同一塊凝膠中進(jìn)行跑膠。而且，看似相同的條帶模式解釋也是非常困難的。

四、血清學(xué)檢測

血清學(xué)檢測通常缺乏特異性和/或敏感性，最好用來檢測群體感染，而不是檢測個體。要用這些試驗進(jìn)行診斷時，須建立這些檢測的敏感性和特異性。但值得注意的是，這些血清學(xué)試驗對老齡禽類和獵禽無效。

最常用的方法是快速血清凝集試驗(RSA)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)和血凝抑制試驗(HI)，還有其它的方法，如放射免疫測定法、微量免疫熒光法和IP測定法等。一個群體的血清測試范圍取決于檢測限和可信度。國際行業(yè)對該檢測的最低要求和測試范圍有規(guī)定，如European Communities Council Directive 90/539/EEC和 美 國NPIP成員國。

家禽公司常用ELISA技術(shù)來大規(guī)模監(jiān)測病毒的抗體滴度，這種方法對于支原體檢測也同樣很適用。在此不具體描述ELISA技術(shù)的細(xì)節(jié)，因為很多MG試劑盒已經(jīng)商業(yè)化，相反，HI試驗還沒有商業(yè)化的試劑盒，所以下面會提到HI試驗的細(xì)節(jié)。

（一）快速血清凝集試驗血清采集自某個雞群，在72 h內(nèi)，如果不是立即檢測，貯存于4℃保存，請勿冷凍。檢測應(yīng)在室溫（20℃～25℃）下進(jìn)行，試劑也放在室溫下即可。在檢測之前離心血清，可以減少非特異性。RSA抗原已經(jīng)商品化，但不同的生產(chǎn)廠商和批次，其特異性和敏感性也會不同。購買的抗原必須按生產(chǎn)廠商的使用說明書保存。合適的RSA染色抗原也可自制，如用結(jié)晶紫染色。

在美國，MG和MS陽性參考血清可以從USDA國家獸醫(yī)服務(wù)實驗室（NVSL）獲得，歐洲可以從法國的AFSSA Ploufragan獲得。不同滴度的雞和火雞的MG、MS和對照血清都能買到。成套的抗血清也可以在Georgia大學(xué)禽病室購買到。

國際上還沒有標(biāo)準(zhǔn)來判定該試驗結(jié)果，但一個群體的血清陽性率高（10%或更高）則表明有MG感染，尤其經(jīng)HI試驗或ELISA驗證的。對于進(jìn)一步驗證，該群體需要在一個月內(nèi)反復(fù)測試。不確定的結(jié)果需要分離培養(yǎng)或鑒定其DNA的存在。MG的疑似結(jié)果可以用MS抗原交叉檢測（反之MS亦然），因為這些病原有時會交叉感染。卵黃和血清一樣，也可以做此檢測，但卵黃必須先稀釋或提取出來。

（二）血凝抑制試驗MG和MS可以凝集禽紅細(xì)胞（RBCs），血清中的特異性抗體可以引起抑制。需要挑選長得好且確定有血凝抑制的菌株。HI試驗需要血細(xì)胞凝集性良好的MG和MS抗原、洗過的新鮮的雞或火雞RBCs、合適的待檢血清?？乖梢允窃谛迈r肉湯培養(yǎng)基上的或是PBS濃縮洗過的支原體細(xì)胞混懸液。要長期保持高滴度的肉湯培養(yǎng)抗原是很困難的。尤其是使用濃縮抗原（通常含有25%～50%甘油，凍存在-70℃）會增加非特異性反應(yīng)的可能性。在美國，MG和MS血凝試驗（HA）抗原可從NVSL購買。

HI試驗可以按已知步驟進(jìn)行?？乖腍A滴度由倍比稀釋檢測獲得。完整的HA試驗體系可以確定最小抗原量的HA單位。HI試驗是用HA的4單位抗原進(jìn)行或用有同樣敏感度的已知陽性血清檢測法。

非特異性HA血清必須去除所有非特異性血細(xì)胞凝集，所以沒有HA抗原的對照孔會出現(xiàn)清晰的沉淀。用1 ml血清稀釋液加6～8滴雞或火雞的RBCs，37℃培養(yǎng)10 min后取出細(xì)胞，上清檢測血細(xì)胞凝集活性。

對于判斷陽性和陰性結(jié)果國際上還沒有官方的標(biāo)準(zhǔn)，但美國的NPIP認(rèn)為，1/80或者更高滴度的為陰性，1/40滴度的就十分可疑了。

（三）酶聯(lián)免疫吸附法一些MG和MS抗體ELISA試劑盒已經(jīng)商品化。其靈敏度會因為不同生產(chǎn)廠商陽性和可疑反應(yīng)的終止水平而不同，有時則刻意降低敏感度來避免MG和MS之間的已知交叉反應(yīng)。ELISA用MAb來識別位于MG 56kDa上的抗原表位。在這種試劑盒中，和常用的間接ELISA一樣，ELISA板用全菌包被，以結(jié)合MAb加入時封閉程度來評價的。MS的ELISA試劑盒是類似的。這種試劑盒的優(yōu)勢是可以適用于所有禽類血清。

雞毒支原體和滑液支原體抗原的質(zhì)量要求：

（1）雞毒支原體抗原。抗原通常 由MG的S6株 和A5969株制備獲得，其他菌株也可以用于制備抗原。

用于RSA的MG抗原：下述質(zhì)量控制只針對用適宜染料染色并含保存劑的MG株混懸液。這種抗原已經(jīng)商品化。鏡檢下，抗原應(yīng)該是均勻的混懸液，沒有絮狀物或沉淀，也沒有殘留的染色劑，還要避免細(xì)菌和真菌的污染。PH須在6.5～7.5±3℃保存，使用前要預(yù)熱至室溫?？乖拿舾行院吞禺愋匀Q于它與已知不同滴度的陽性血清和已知陰性血清的反應(yīng)性。陽性反應(yīng)會出現(xiàn)有色的絮狀物，培養(yǎng)液澄清。以上描述的判定標(biāo)準(zhǔn)在生產(chǎn)廠商標(biāo)注的有效期內(nèi)都適用。用于HI試驗的MG抗原：試驗最好使用生長旺盛期的活菌進(jìn)行?？乖仨毐苊饧?xì)菌和真菌的污染。用于ELISA的MG抗原：如果沒有先前的大量試驗和對敏感性和特異性的確定，要制備用于間接ELISA的令人滿意的抗原是十分困難的。大多數(shù)實驗室診斷最好的方法是使用可靠的商品化試劑盒。一些試劑盒是USDA認(rèn)證的，可以在美國的NPIP中使用。

（2）滑液囊支原體抗原?？乖ǔＳ蒞VU1853毒株制備，其它菌株也可以使用。用于RSA的滑液囊支原體抗原：其規(guī)則和制備用于RSA的MG抗原相似。用于HI試驗的滑液囊支原體抗原：其規(guī)則和制備用于HI試驗的MG抗原相似。

（3）附加注釋。RSA中非特異性反應(yīng)的血清不一定在用HA抗原的HI試驗中呈陽性反應(yīng)。初次感染后2～3周（HI抗體產(chǎn)生所需時間）的血清進(jìn)行HI試驗可確證RSA陽性反應(yīng)。但HI試驗具有菌株特異性，因此敏感性不強。ELISA是另一種有效的選擇。血清樣品在RSA試驗前無需冷凍，要避免溶血和污染而導(dǎo)致的非特異性反應(yīng)。其它疾病滅活疫苗的使用亦會導(dǎo)致非特異性反應(yīng)。樣品檢測越早進(jìn)行越好（72 h之內(nèi)），因為支原體抗體在保存過程中會變質(zhì)。血清需在56℃水浴30 min滅活。

（略）