MMP-9抑制劑巴馬司他對體外循環(huán)犬肺組織中 iNOS表達的影響

馮俊波,葛圣林*,龔文輝,張成鑫

(1安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院,合肥 230022；2安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院)

體外循環(huán)(CPB)過程中,缺血再灌注(IR)可致急性肺損傷。實驗表明,IR時肺組織中誘生型一氧化氮合酶(iNOS)活性增強[1],導致生成大量的 NO,與超氧陰離子結合后,使過氧化亞硝酸堆積,加重肺組織損傷。基質金屬蛋白酶 9(MMP-9)能降解肺毛細血管基底膜中的細胞外基質(ECM)成分,使肺毛細血管通透性增加和炎性細胞進一步浸潤[2]。2008年 3月 ～2009年 3月,我們觀察了外源性 MMP-9抑制劑巴馬司他對犬體外循環(huán)肺組織中 iNOS表達的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 16只出生半年左右的健康雜種幼犬(體質量 10～12 kg),MMP-9 ELISA試劑盒,巴馬司他,戊巴比妥鈉,iNOS試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組與 CPB模型的建立 將幼犬隨機分為對照組和實驗組,各 8例。兩組均建立 CPB模型:戊巴比妥鈉 30 mg/kg靜注,22 G留置針插犬右下肢動脈測動脈血壓及備取血樣用,22 G留置針插犬左下肢靜脈備輸液及備取血樣用；行氣管插管,機械通氣,輔助呼吸。FiO2100%,潮氣量 15 ml/kg,頻率 15～18次/min。前正中切口,靜脈給予肝素 600 U/kg,檢測激活凝血時間(ACT)＞480 s。升主動脈插管(4 mm),上下腔插管(36 Fr),經肺動脈插入10F動脈灌注管,左房放置 18F靜脈引流管。心肌保護采用改良 St.Thomas液 10 ml/kg,每 30 min灌注 1次。降溫,泵流量 50～80 ml/(kg? min)轉流,建立 CPB模型。CPB 60 min后開放主動脈,心臟復跳,恢復肺動脈血供,維持循環(huán)穩(wěn)定,并持續(xù)呼吸機輔助通氣,90 min撤離 CPB。于術后 3 h 10%KCl處死實驗犬。

1.2.2 巴馬司他應用方法 實驗組在升主動脈阻斷后,用含巴馬司他 30 mg/kg的肺保護液(654-2、NaHCO3等,滲透壓為 350 Osm)持續(xù)灌注肺動脈,流量為 30 ml/(kg?min),開放升主動脈后停止灌注。對照組灌注不含巴馬司他的肺動脈保護液,方法同實驗組。

1.2.3 犬肺組織病理觀察 CPB結束后,取左上肺標本,用 4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水,石蠟包埋切片,HE染色,光鏡下觀察肺組織病理形態(tài)變化。同時,另取左上肺標本,用戊二醛迅速固定,切割成1 mm3大小的 6塊。戊二醛固定、漂洗、鋨酸固定、包埋、聚合、切片,醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色,用Jeol JEM-1230透射電鏡觀察形態(tài)學改變。

1.2.4 犬肺組織中 iNOS檢測方法 取肺組織塊 1 g,放入預冷的緩沖液 9 ml中,用勻漿器制成 10%的肺組織勻漿。取肺組織勻漿 4℃ 3 000 r/min離心15 min,取上清液,按 iNOS試劑盒說明書應用酶譜儀測量標準物及各個樣品的光密度(OD值)。以標準物的濃度為橫坐標(對數(shù)坐標),OD值為縱坐標(普通坐標),在半對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線,用標準物的濃度與 OD值計算出標準曲線的直線回歸方程式。將樣品的 OD值代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數(shù),即測量出各樣品中 iNOS水平。

1.2.5 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS13.0統(tǒng)計軟件。應用 Levene檢驗對各組數(shù)據(jù)間進行方差齊性檢驗,兩組間比較應用 LSD-t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組犬肺組織病理變化 光鏡下,實驗組肺泡結構較完整,肺泡腔清晰,炎癥改變相對較輕,水腫及出血減少；對照組肺泡壁彌漫性滲出水腫,毛細血管擴張充血,肺泡壁和肺間質內可見大量白細胞浸潤以及肺泡結構破壞。電鏡下,對照組肺泡Ⅱ型上皮細胞基底膜變薄,細胞游離面微絨毛消失,線粒體腫脹破裂,嵴紊亂消失,多數(shù)板層小體排空,形成較大空泡；實驗組肺泡Ⅱ型上皮細胞形態(tài)較對照組明顯好轉,細胞游離面微絨毛有序排列,線粒體輕度腫脹,嵴排列稍紊亂,板層小體空泡化較對照組明顯減輕。

2.2 兩組犬肺組織中 iNOS水平比較 實驗組犬肺組織中 iNOS為(1.69±0.32)U/mg prot,明顯低于對照組的(2.25±0.43)U/mg prot,P＜0.05。

3 討論

CPB后肺損傷發(fā)生的具體機制尚未完全清楚,但中性粒細胞釋放的血漿蛋白酶如基質金屬蛋白酶(MMPs)已被認為與 CPB引起的急性肺損傷和ARDS密切相關[3]。MMP-9是 MMPs家族中一種依賴鋅離子的金屬蛋白酶,參與 ECM的降解和重建,并可作為中性粒細胞的趨化因子,引起中性粒細胞聚集。MMP-9可降解由Ⅳ型膠原等組成毛細血管和肺泡上皮的基膜,導致肺毛細血管通透性增加,使富含蛋白的血漿進入肺泡,發(fā)生肺水腫、肺內分流增加、低氧血癥等,最終導致急性肺損傷甚至 ARDS。近年來,越來越多研究證實 MMP-9在 CPB后循環(huán)中明顯增加[4],且與急性肺損傷明顯相關。金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMPs)是一種內源性 MMPs抑制劑,可以抑制所有的 MMPs。TIMPs與 MMPs之間的平衡是 ECM維持完整的前提條件。在急性肺損傷過程中存在 TIMPs和 MMPs的失衡,應用 TIMPs可減輕肺損傷程度。巴馬司他是 MMPs的外源性特異性抑制劑,其首先作為抗腫瘤尤其是抗腫瘤轉移藥物被開發(fā)應用的,且動物的急性和長期毒性實驗表明無明顯毒性。鑒于 MMP-9在 CPB急性肺損傷發(fā)病中的重要作用,我們認為 MMPs抑制劑可能在CPB急性肺損傷的治療中發(fā)揮重要作用。

一氧化氮合酶(NOS)的主要功能是催化 L-精氨酸生成 NO。NO作為一種重要的信使分子,具有維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定和保護細胞的作用。NO能舒張平滑肌(選擇性擴張肺血管,調節(jié)氣道平滑肌的張力),抑制炎癥介質釋放(抑制白細胞黏附及趨化,抑制血小板黏附及聚集等),從而降低肺血管阻力(PVR),減少肺內分流,改善供肺的氧合,但大量NO對機體有氧化損傷和致炎癥作用。目前發(fā)現(xiàn)并定名的人體內NOS有3種,Ⅰ型主要存在腦和神經細胞的細胞質內,稱為腦型(bNOS)或神經型(nNOS)；Ⅲ型主要存在于血管內皮細胞的細胞膜上,稱為內皮型(eNOS)；Ⅰ型和Ⅲ型又統(tǒng)稱構成型(cNOS),是許多正常組織中正常存在的一種酶。其合成的 NO在維持神經細胞的效應傳遞功能和血管的舒縮功能等方面有重要作用。Ⅱ型稱為 iNOS,存在于巨噬細胞、中性粒細胞、肥大細胞、內皮細胞等細胞中,只在細胞受到刺激被激活后才表達。其生成 NO的量比 cNOS高出上千倍,能持續(xù)產生 NO數(shù)日[5]。

研究發(fā)現(xiàn),iNOS與 IR損傷密切相關。文獻報道,離體肺 IR損傷后,eNOSmRNA表達降低,而 iNOSmRNA表達增高[6]。有實驗表明,肺損傷時肺組織中的 NO主要來源于 iNOS,而 eNOS的作用很小[7]。iNOS的生成增加可產生大量的NO,NO能破壞細胞代謝、損傷 DNA引起細胞死亡；并能直接損傷組織,促進吞噬細胞分泌腫瘤壞死因子(TNF),繼而增加細胞因子介導的組織損傷。大量生成的 NO可與氧自由基結合,生成毒性更強的過氧亞硝酸離子。有文獻報道,iNOS本身也具有氧自由基生成活性,能誘導 O-2的生成[8]。曹華等[9]實驗證實,再灌注肺組織中 eNOS表達下調,iNOS在肺泡上皮細胞、內皮細胞、平滑肌細胞的表達明顯增強。胡靜等[10]研究表明,應用 iNOS抑制劑氨基胍,能明顯減輕博萊霉素引起的肺損傷。

我們采用外源性 MMP-9抑制劑巴馬司他進行犬 CPB模型的肺動脈灌注,常規(guī)病理及電鏡顯示實驗組肺損傷程度較對照組明顯減輕,實驗組肺組織iNOS表達量低于對照組,提示應用巴馬司他進行肺動脈灌注,能減輕 CPB中的肺損傷,減少肺組織中iNOS的產生。其原因可能是缺血狀態(tài)下 eNOS表達下調,NO合成減少,加劇了血小板聚集,白細胞黏附,產生大量 TNF、IL-21、IL-28等細胞因子和內毒素,誘導肺內 iNOS表達增強[11]。而巴馬司他能抑制 MMP-9引起中性粒細胞聚集,減少了 TNF、IL-21、IL-28等細胞因子的產生,從而減少了肺組織內iNOS的生成。

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