單克隆抗體制備技術(shù)及臨床應(yīng)用的研究進展*

張 華 胡成進

(1.泰山醫(yī)學院免疫學教研室，山東 泰安 271016; 2.濟南軍區(qū)總醫(yī)院實驗診斷科，山東 濟南 250031)

1975年Kohler和Milstein建立了雜交瘤技術(shù)，將小鼠骨髓瘤細胞與產(chǎn)生綿羊紅細胞抗體的小鼠脾細胞融合,形成的雜交瘤細胞既能產(chǎn)生抗體又能進行分裂繁殖，且產(chǎn)生的抗體只能識別一種抗原決定簇，稱為單克隆抗體,單克隆抗體經(jīng)歷了鼠源性、人源性和全人化抗體三個階段。迄今為止世界上已研制出數(shù)以千計的單克隆抗體，并廣泛應(yīng)用于生物學、醫(yī)學領(lǐng)域,在疾病的發(fā)病機制、診斷和治療方面發(fā)揮重要作用。本文從單克隆抗體的制備技術(shù)和臨床應(yīng)用方面進行綜述。

1 單克隆抗體制備技術(shù)

1.1 雜交瘤技術(shù)

該技術(shù)主要包括免疫動物、細胞融合和雜交瘤細胞的篩選三個環(huán)節(jié)。

1.1.1免疫動物 目前常用BALB/C小鼠，也可用SCID 小鼠(severe conbined immumdeficiemy mice)、轉(zhuǎn)基因小鼠、轉(zhuǎn)染色體小鼠，用特定的外來抗原一次或多次免疫動物,刺激B淋巴細胞增殖形成漿細胞，分泌針對該抗原的抗體。

1.1.2細胞融合 常用骨髓瘤細胞和小鼠脾細胞融合，通常采用PEG法或PEG電融合法，該法穩(wěn)定，安全簡單；也有報道用小鼠的腘窩淋巴結(jié)細胞和骨髓瘤細胞融合，5周內(nèi)成功產(chǎn)生抗病毒的小鼠單抗。

1.1.3雜交瘤細胞篩選 HAT選擇培養(yǎng)基有3種關(guān)鍵成分：次黃嘌呤(hypoxanthine，H)、甲氨蝶呤(aminopterin，A)和胸腺嘧啶核苷(thymidine，T)，A 是二氫葉酸還原酶抑制劑，可阻斷核酸合成的主要途徑。B淋巴細胞可通過補救途徑，由胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)和次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosy transferase,HGPRT)利用T 和H合成核酸，但不能在體外長期生存；骨髓瘤細胞缺乏HGPRT，不能在該培養(yǎng)基中生長；雜交瘤細胞具有B淋巴細胞和骨髓瘤細胞的雙重特性，在HAT培養(yǎng)基中長期生存又可產(chǎn)生抗體，成為制造單克隆抗體的細胞源。

雜交瘤技術(shù)所產(chǎn)生的抗體特異性高、純度高，可大規(guī)模生產(chǎn)，但實驗程序復雜且鼠源性單抗具有免疫原性，促使人體產(chǎn)生特異性抗體，引起過敏反應(yīng)，另外在人體內(nèi)半衰期比較短，常不能有效激活抗體依賴細胞介導的細胞毒反應(yīng)和補體依賴的細胞毒反應(yīng)。

1.2 基因工程抗體技術(shù)

1.2.1嵌合抗體 將小鼠抗體的可變區(qū)基因與人免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)恒定區(qū)基因重組，構(gòu)建人/鼠嵌合重鏈、輕鏈基因，在原核或真核細胞中表達。該抗體減少了鼠單抗的免疫原性，恒定區(qū)可有效發(fā)揮補體激活和與FC受體結(jié)合的生物學活性。

1.2.2重構(gòu)抗體 將編碼小鼠單抗決定簇互補區(qū)基因序列移植到編碼人Ig可變區(qū)的骨架區(qū),構(gòu)建新的抗體。該方法與嵌合抗體相比，雖減少了人抗鼠抗體反應(yīng)，但仍然保持著鼠源性抗體的特異性。

1.2.3小分子抗體 常用的小分子抗體有單鏈抗體、重組Fab片段、單域結(jié)構(gòu)、雙特異性抗體、免疫粘連素、催化抗體等。單鏈抗體由一段編碼連接肽基因連接抗體的重、輕鏈的可變區(qū)基因(variable region heavy chain，VH、variable region light chain，VL)表達形成的重組蛋白；雙特異性抗體是由氨基酸殘基連接起來的兩個不同小分子抗體，能夠結(jié)合兩種抗原，介導標記物與靶抗原的結(jié)合或某些效應(yīng)因子定位于靶細胞；免疫粘連素是由Ig恒定區(qū)基因連接人細胞受體或粘附分子基因，在真核細胞中表達的融合蛋白。小分子抗體分子量小、穿透性強、抗原性低、半衰期短，可在原核系統(tǒng)表達，易于進行基因工程操作，因此受到廣泛重視。

1.2.4展示技術(shù)

1.2.4.1噬菌體展示技術(shù) 該技術(shù)屬于體內(nèi)展示技術(shù)，其原理是通過RT-PCR克隆擴增人淋巴細胞譜中的VH和VL基因片段，導入噬粒，轉(zhuǎn)化細胞，建立噬菌體抗體文庫，此時噬菌體核心DNA中有編碼人抗體VH、VL基因片段，所編碼蛋白與噬菌體膜蛋白相連，分布于噬菌體表面?？赏ㄟ^多次“吸附——洗脫——擴增”，篩選出特異性的全人化抗體可變區(qū)基因。具體制備方法如下：將抗原包被在固相介質(zhì)上，特異性的噬菌體與抗原結(jié)合，洗脫未結(jié)合的噬菌體，篩選出針對特定抗原的抗體可變區(qū)基因，再用此噬菌體感染宿主菌，擴增該噬菌體顆粒，制備出全人化抗體。該方法簡單，所需時間短，但由于表達系統(tǒng)的限制，一些稀有抗體不易制備，且對噬菌體生長或功能產(chǎn)生抑制作用的抗體也難以獲得。

1.2.4.2核糖體展示技術(shù) 1997年，Hanes和Plukthun建立了核糖體展示技術(shù)，該技術(shù)屬于無細胞轉(zhuǎn)化技術(shù)，不受細胞轉(zhuǎn)染和表達系統(tǒng)的限制。其原理是形成抗體-核糖體-mRNA復合體，具體方法如下：先構(gòu)建目的抗體基因DNA文庫，引入T7 啟動子、核糖體結(jié)合位點，轉(zhuǎn)錄成mRNA；在體外無細胞翻譯系統(tǒng)中形成mRNA-核糖體-抗體復合物；通過多次的“吸附——洗脫——擴增”，篩選出特異性的mRNA。該技術(shù)完全在體外進行，可改變無細胞翻譯系統(tǒng)環(huán)境，確?？贵w分子的正確折疊，且抗體庫庫容可達1015，還可聯(lián)合使用一些特殊的PCR技術(shù)，如性別PCR、錯配PCR，獲得更廣的遺傳多樣性。

1.2.4.3mRNA體外展示技術(shù) 一種新興的高效多肽選擇技術(shù),其原理是將抗體庫中DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，含嘌呤霉素寡核苷酸的Linker將其與它所編碼的肽或蛋白共價結(jié)合,形成mRNA-嘌呤霉素-蛋白復合物。與mRNA-核糖體-蛋白復合物相比，該復合物更為穩(wěn)定，在4℃可完整保存10天左右，篩選到的抗體親和性也比較高。

2 單克隆抗體的臨床應(yīng)用

2.1 疾病發(fā)病機制的應(yīng)用

Salah Aref等[1]應(yīng)用流式細胞術(shù)和單克隆抗體特異性俘獲血小板抗原技術(shù)檢測丙型肝炎病毒感染引起的血小板減少癥病人血清中抗血小板抗體(anti-platelet antibodies，PA)，結(jié)果顯示總PA Ig、IgG、IgM 、IgA的陽性率分別達到86.7%、83.3%、46.7%和33.3%，且 86.7%的病人有PAIg，推斷PAIg可誘導丙型肝炎病毒感染病人血小板減少癥的發(fā)生。Linlin Qu等[2]觀察阿侖單抗對小鼠腸上皮淋巴細胞(intestinal intraepithelial lymphocytes，IELs)的影響，取阿倫單抗處理小鼠的回腸和結(jié)腸做組織病理和免疫組化，并用流式細胞儀檢測IELs，與正常組作比較，發(fā)現(xiàn)處理組小鼠的IELs數(shù)量和活力明顯降低，凋亡細胞數(shù)量明顯增高，推斷阿倫單抗可破壞小腸上皮內(nèi)屏障作用，引起細菌感染。也有報道[3-4]稱莫羅單抗與移植后的淋巴細胞增多癥有關(guān)。

2.2 疾病診斷方面的應(yīng)用

以單克隆抗體為基礎(chǔ)建立起來的方法，如ELISA、膠體金、流式細胞術(shù)、電化學發(fā)光、免疫熒光法等，有效提高了檢測方法的靈敏度、特異度，在疾病診斷中發(fā)揮著重要作用。Shangjin Cui等[5]建立膠體金的方法檢測抗禽流感病毒H5亞型抗體，選取830例雞血清，結(jié)果該方法簡單快速，且敏感度達88.8%，特異度達97.6%。佟海俠等[6]應(yīng)用流式細胞術(shù)對192例急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia,AML)患者進行免疫分型，發(fā)現(xiàn)免疫分型對AML的診斷和分型至關(guān)重要。Na Young Ji等[7]應(yīng)用ELISA方法檢測肝細胞癌病人血清中的膜連蛋白Ⅱ(Annexin A2, ANXA2)，發(fā)現(xiàn)ANXA2可作為肝細胞癌的血清標志，ANXA2的過量表達有助于肝細胞癌的診斷。

2.3 疾病治療方面的應(yīng)用

單克隆抗體作為一種新型藥物廣泛應(yīng)用于臨床，該類藥物靶向性強、特異性高、毒副作用低，在抗腫瘤和自身免疫系統(tǒng)疾病治療領(lǐng)域得到了有力推廣。在抗腫瘤治療中，單克隆抗體與放射性核素、毒素、藥物等連接，發(fā)揮針對腫瘤細胞的靶向治療，從分子水平逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞的惡性生物學行為，因而有“生物導彈”之稱。Hong Song等[8]報道用放射性核素225Ac偶聯(lián)抗體治療小鼠轉(zhuǎn)移性乳腺癌，也有報道用213Bi標記單克隆抗體治療前列腺癌[9]、卵巢癌[10]、結(jié)腸癌[11]。眾所周知莫羅單抗可用于腎移植病人的免疫排斥反應(yīng)，D. Desai等[12]也發(fā)現(xiàn)抗細胞因子抗體可用于治療嚴重哮喘。

3 未來展望

單克隆抗體是未來治療學上的一大研究熱點，有報道[13]稱單克隆抗體藥物將成為生物醫(yī)藥研究的主旋律。雖然單克隆抗體還存在一些問題，如需降低抗體的免疫原性，但隨著噬菌體展示技術(shù)、核糖體展示技術(shù)以及mRNA體外展示技術(shù)的發(fā)展，單克隆抗體朝著全人化的方向發(fā)展，且制備時間大大縮短、成本大大降低，更有利于各種診斷試劑盒和各種疾病治療藥物的研制，因此我們相信單克隆抗體具有更廣闊的前景。

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