快速微乳電動(dòng)毛細(xì)管色譜法同時(shí)測(cè)定忍冬藤中11種有效成分

1 引 言

忍冬藤為忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥莖枝，產(chǎn)于我國(guó)大部分地區(qū)。忍冬藤具有抗炎、預(yù)防和治療肝纖維化、止血、抗病毒等功效。目前，分析評(píng)價(jià)忍冬藤質(zhì)量的方法主要有分光光度法、高效液相色譜法。本研究采用快速的微乳電動(dòng)毛細(xì)管色譜法同時(shí)分離并測(cè)定了忍冬藤藥材中的馬錢子苷、當(dāng)藥苷、綠原酸等11種有效成分。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑 G1600A 毛細(xì)管電泳儀（美國(guó)Agilent公司）；未涂層石英毛細(xì)管(60 cm ×50 μm i.d.， 有效長(zhǎng)度為51.5 cm， 河北永年銳豐色譜器件公司); pHS-4A 型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠); HS3120 型超聲波提取器（淮陰漢邦公司）。

對(duì)照品：馬錢子苷(1)、當(dāng)藥苷(2)、Secologamin(3)、木犀草苷 (4)、Dimethy-secologamoside (5)、蘆丁(6)、異槲皮苷(7)、金絲桃苷(8)、綠原酸(9)、異綠原酸(10)、木犀草素(11)、毛蕊異黃酮苷(內(nèi)標(biāo))，上述對(duì)照品除金絲桃苷和綠原酸購(gòu)自中國(guó)生物制品檢定所外，其余均為本實(shí)驗(yàn)室從忍冬藤樣品中分離（經(jīng)UV、MS和NMR鑒定，純度＞98.0％），內(nèi)標(biāo)選用毛蕊異黃酮苷，忍冬藤樣品分別采自長(zhǎng)沙、亳州、杭州、香港、鄭州、深圳、封丘等地，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室李萍教授鑒定為忍冬科植物忍冬的藤，甲醇(色譜純，Merck公司)。 其它試劑均為分析純（南京化學(xué)試劑廠）。超純水由Milli-Q系統(tǒng)制備。

2.2 對(duì)照品貯備液與內(nèi)標(biāo)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取各對(duì)照品：馬錢子苷0.94 mg、當(dāng)藥苷1.03 mg、Secoxyloganin 1.32 mg、木犀草苷0.69 mg、Dimethy-secologamoside 0.86 mg、蘆丁0.96 mg、異槲皮苷1.01 mg、金絲桃苷0.90 mg、綠原酸1.72 mg、異綠原酸1.31 mg、木犀草素1.01 mg，分別置于1 mL容量瓶中，加入1.0 mL 50%甲醇溶解，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。準(zhǔn)確稱取毛蕊異黃酮苷2.07 mg，加入1 mL 50%甲醇溶解，搖勻，配制成含毛蕊異黃酮苷2.07 g/L的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 供試品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取忍冬藤藥材粉末（過250 μm篩）約0.5 g，至具塞錐形瓶中，加入10 mL 50%甲醇，稱定重量。超聲45 min，冷卻，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，過濾。濾液再經(jīng)0.22 μm濾膜過濾， 吸取0.5 mL，加入2.07 g/L 20 μL內(nèi)標(biāo)溶液，作為供試品溶液。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)條件 運(yùn)行緩沖液由3%SDS-0.6%正庚烷-6%正丁醇-90.4%硼酸（10 mmol/L，pH 9.0）緩沖溶液組成， 超聲30 min。所有溶液使用前均用0.22 μm濾膜過濾。兩次進(jìn)樣間用0.1 mol/L NaOH、BGE清洗2 min。進(jìn)分析樣兩次更換一次BGE溶液。采用壓力進(jìn)樣：5 kPa×3 s；運(yùn)行電壓30 kV；柱溫 25 ℃; 檢測(cè)波長(zhǎng): 254 nm （經(jīng)過DAD全波長(zhǎng)掃描，3類化合物在254 nm波長(zhǎng)下均有最大吸收，故檢測(cè)波長(zhǎng)選擇為254 nm）。所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下進(jìn)行。

3 結(jié)果與討論

3.1 校準(zhǔn)曲線和測(cè)量精密度 吸取適量上述對(duì)照品貯備液， 分別加入20 μL 2.07 g/L內(nèi)標(biāo)溶液，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣分析，以相對(duì)峰面積值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)繪制校準(zhǔn)曲線，大部分目標(biāo)物的線性范圍為6.0～200 ng/L。取適量對(duì)照品溶液，加入20 μL 2.07 g/L內(nèi)標(biāo)溶液，搖勻，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄各色譜峰相對(duì)校正峰面積，測(cè)得各個(gè)化合物的日內(nèi)精密度為0.66%~1.84%。上述溶液每天進(jìn)樣2次，連續(xù)進(jìn)樣3 d，記錄各色譜峰相對(duì)校正峰面積，測(cè)得各個(gè)化合物的日間精密度為1.38%~2.83%。

3.2 回收率和樣品測(cè)定 準(zhǔn)確稱取已知含量的藥材粉末0.25 g， 共3份， 定量加入11種標(biāo)準(zhǔn)品（50 mg/L），按2.3節(jié)制備樣品液進(jìn)樣分析。各化合物的標(biāo)準(zhǔn)加入的平均回收率為70.4%～107.1%。

10個(gè)產(chǎn)地的忍冬藤樣品的分析結(jié)果表明，忍冬藤中Dimethy-secologamoside、綠原酸及異綠原酸的含量較高，異槲皮苷和金絲桃苷的含量最低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的樣品由于生長(zhǎng)環(huán)境的差異， 其成分有較明顯的差別（全文詳見http://www.analchem.cn/fujian/080654.pdf）。