microRNAs的臨床運(yùn)用探討

郭建生，陳士偉

(1、空軍杭州航空醫(yī)學(xué)鑒定訓(xùn)練中心，浙江 杭州 310007；2、長海醫(yī)院實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200433)

1993 年Lee等[1]利用遺傳分析的方法在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)第一個(gè)22個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA-lin-4開始，microRNA(miRNA)被帶入了研究領(lǐng)域，但直到最近幾年這類基因的多樣性和廣泛性才被揭示出來。一系列的研究表明，microRNA在機(jī)體正常發(fā)育、分化、生長及凋亡中發(fā)揮重要的作用，如胚胎發(fā)育、細(xì)胞生長和凋亡、血細(xì)胞分化、神經(jīng)元的極性、胰島素分泌、大腦形態(tài)形成、心臟發(fā)生和脂肪代謝等，隨著研究的進(jìn)展，對(duì)miRNA的研究從量的表象變化已經(jīng)慢慢過渡到作用機(jī)制，進(jìn)入了更深一步的研究。隨著檢測(cè)方法的進(jìn)步，一個(gè)新的領(lǐng)域—循環(huán)miRNA也逐漸成為科研的熱點(diǎn)，成為潛在的檢測(cè)標(biāo)志物和治療靶向點(diǎn)。miRNA與多種疾病的發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)系，本文對(duì)此進(jìn)行部分闡述。

1 miRNA概述

miRNA(miRNA)是一類有大約1923個(gè)核苷酸組成的非編碼小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、個(gè)體發(fā)育、病毒感染及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等方面具有重要的生物學(xué)功能。它們由細(xì)胞核內(nèi)基因組DNA轉(zhuǎn)錄成RNA，經(jīng)過特異性核酸酶drosha第一次切割形成pre-microRNA，利用運(yùn)輸?shù)鞍?5到達(dá)胞漿后再經(jīng)過Dicer酶的第二次切割而得到成熟miRNA，其通過RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)靶向到達(dá) mRNA，與靶基因 3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)完全或部分互補(bǔ)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA翻譯抑制并參與RNA干擾反應(yīng)，使相應(yīng)基因表達(dá)水平下降[2]。miRNA與靶mRNA完全互補(bǔ)配對(duì)后，mRNA被降解，若miRNA與靶mRNA不完全互補(bǔ)，則起到封閉靶mRNA的作用，抑制其翻譯過程[3]。編碼miRNA的基因占全部預(yù)測(cè)基因的1～5%，每種miRNA可調(diào)控多種靶基因，一個(gè)靶基因可能受不同miRNA的調(diào)控，改變?nèi)祟惖鞍谆虻谋磉_(dá)，維持機(jī)體的功能[4]。

2 miRNA與疾病

2.1 miRNA與腫瘤

miRNA表達(dá)與腫瘤的相關(guān)性是最有吸引力的研究。提取腫瘤組織細(xì)胞的RNA，利用microarray分析發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織與周圍的正常組織相比較miRNA表達(dá)水平有不同程度的上調(diào)或下調(diào)，發(fā)生miRNA圖譜改變，這一現(xiàn)象初步肯定了腫瘤發(fā)生與miRNA表達(dá)之間具有一定的相關(guān)性。已經(jīng)有大量文獻(xiàn)報(bào)道疾病中有關(guān)的組織或細(xì)胞miRNA圖譜發(fā)生變化，特別是腫瘤miRNA表達(dá)譜可以提示其組織來源，同時(shí)也證明miRNA表達(dá)譜有助于人類腫瘤的組織分型，而且miRNA表達(dá)譜在提示組織譜系方面比傳統(tǒng)的miRNA表達(dá)譜效果更好。此外，miRNA表達(dá)譜還可以為低分化腫瘤找到其組織來源[5]。

miRNA既可作為抑癌基因，下調(diào)原癌基因的活性，也可作為癌基因，下調(diào)抑癌基因的活性。Calin GA等[6]首次驗(yàn)證了microRNA在某些類型的白血病和淋巴瘤中發(fā)生了功能障礙，其中miR-15和miR-16起著關(guān)鍵作用，這兩種miRNA通過抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡過程，Bcl-2蛋白主要通過作用于線粒體來實(shí)現(xiàn)其抑制凋亡的生物學(xué)活性，因此當(dāng)miR-15和miR-16丟失或突變時(shí)，Bcl-2蛋白的表達(dá)量上調(diào)，細(xì)胞凋亡受阻，因而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。作為癌基因的miR-21，研究證明在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中表達(dá)升高，同時(shí)乳腺癌樣品中表達(dá)也有增加，故認(rèn)為miR-21可能在腫瘤發(fā)生中起到廣泛的作用。而人的肺癌細(xì)胞中瞬時(shí)的表達(dá)let-7，作為抑癌基因，可以抑制細(xì)胞的增殖，如果肺癌患者的let-7表達(dá)降低，患者預(yù)后更差，非小細(xì)胞肺癌患者的let-7表達(dá)水平越低，其預(yù)后越差，術(shù)后生存期越短。同時(shí)最近研究也發(fā)現(xiàn)miR-31抑制抑癌基因促進(jìn)肺癌的發(fā)生，它作用的目標(biāo)基因是抑癌基因Last2(large tumor suppressor 2)和Ppp2r2a(PP2A regulatory subunit B alpha isoform)，與它們結(jié)合后促進(jìn)腫瘤的生成，抑制抑癌基因發(fā)揮抑癌作用，人工敲除miR-31，Lats2和Ppp2r2a表達(dá)明顯上升，肺癌病人和肺癌鼠的miR-31和目標(biāo)mRNA的表達(dá)相反，充分證實(shí)了這個(gè)結(jié)論[7]。

2.2 miRNA與內(nèi)分泌疾病

在我國內(nèi)分泌疾病有很大的人群，從功能上說主要表現(xiàn)為兩種情況，一是功能亢進(jìn)，二是功能減退，雖然發(fā)病緩慢，但對(duì)病人造成的痛苦不可小覷。miRNA的出現(xiàn)為內(nèi)分泌疾病的診斷和治療帶來了新的思路和方法。從胰腺B細(xì)胞分泌、胰島素的作用等每個(gè)環(huán)節(jié)都有miRNA的參與，而且影響其它相關(guān)分子。對(duì)來自1型糖尿病和正常人的Treg細(xì)胞進(jìn)行miRNA篩查，利用TaqMan arry分析發(fā)現(xiàn)與正常人相比1型糖尿病病人Treg細(xì)胞miR-510上升近100倍，而miR-342和miR-191下降為近2倍和3倍。雖然具體的作用機(jī)制還沒有明確，但圖譜的改變已經(jīng)說明miRNA在1型糖尿病中的重要作用[8]。

雌激素受體(ERα)是配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，由荷爾蒙、DNA、和轉(zhuǎn)錄活化因子幾個(gè)重要結(jié)合區(qū)域組成，miR-22與表達(dá)ERα的mRNA的3’端非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合強(qiáng)力抑制ERα產(chǎn)生，過表達(dá)的miR-21通過誘導(dǎo)mRNA的降解而使ERα產(chǎn)生減少使雌激素的作用減弱，因而可以從另一方面思考miR-21的過表達(dá)可以抑制雌激素依賴性乳腺癌細(xì)胞的生長[9]。MiR-18已經(jīng)被證實(shí)作用于編碼ERα的基因ESR1，過表達(dá)MiR-18降低ERα水平但同時(shí)促進(jìn)肝癌細(xì)胞 (HCC)的增殖，對(duì)女性肝癌病人來說miR-18的過表達(dá)阻礙了雌激素潛在的保護(hù)作用而促進(jìn)了肝癌的發(fā)展[10]。

2.3 miRNA與自身免疫性疾病

已經(jīng)證實(shí)miRNA在免疫調(diào)節(jié)和免疫細(xì)胞發(fā)育扮演了重要角色。到目前為止，已經(jīng)揭示一群特異性的miRNA在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。利用LPS對(duì)人monocytic THP-1細(xì)胞進(jìn)行刺激發(fā)現(xiàn)miR-146、miR-155和miR-132上調(diào)，TNF-a和IL-1b可以誘導(dǎo)miR-146的表達(dá)。進(jìn)一步的分析揭示這是NFkB依賴性的[11]。由IFN-b和多種TLR配體的作用，鼠巨噬細(xì)胞miR-155表達(dá)上升，這些說明miR-155參與細(xì)菌和病毒的先天性免疫。而LPS刺激鼠巨噬細(xì)胞會(huì)引起miR-125的下調(diào)，因此推斷miR-125可能作用于TNF-amRNA，在LPS誘導(dǎo)TNF-a產(chǎn)生時(shí)miR-155表達(dá)下調(diào)[12]。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一種自身免疫性疾病，產(chǎn)生多種自身物質(zhì)的抗體包括染色質(zhì)、核糖和磷脂等而且臨床表現(xiàn)多樣。Dai等利用microarry分析來自23名SLE患者和10名健康者的外周血單核細(xì)胞 (peripheral blood mononuclear cell，PBMC)miRNA的表達(dá)，結(jié)果得出7種 miRNAs(miR-196a，miR-17-5p，miR-409-3p，miR-141，miR-383，miR-112，and miR-184) 表達(dá)下調(diào)，9 種 miRNAs(miR-189，miR-61，miR-78，miR-21，miR-142-3p，miR-342，miR-299-3p，miR-198，andmiR-298)表達(dá)下調(diào)[13]。對(duì)狼瘡腎炎活檢組織的miRNA的圖譜分析也有改變，36種上調(diào)和30種下調(diào)[14]。這些資料表明對(duì)于SLE患者miRNA可作為潛在診斷標(biāo)志物和疾病相關(guān)分析因子。

2.4 miRNA與其它

皮膚是人體分布最廣的器官，在表皮和毛囊中的一些miRNA的高表達(dá)是皮膚正常發(fā)育必不可少的，將鼠胚胎皮膚祖細(xì)胞Dicer敲除發(fā)現(xiàn)皮膚上皮不能產(chǎn)生成熟miRNA，毛胚芽進(jìn)入表皮層而不是正常的到真皮層。正常毛囊分化關(guān)鍵信號(hào)分子(sonic hedgehog，Shh 和 Notch homolog 1，Notch1)的表達(dá)在出生后7d消失[15]。MiR-203與皮膚形成有關(guān)，胚胎發(fā)育至13.5～15.5d時(shí)，鼠基底層細(xì)胞相比基底細(xì)胞miR-203增高25倍，miR-203抑制p63的表達(dá)，p63是表皮細(xì)胞增殖和分化的重要因子[16]，在胚胎形成中p63基因啟動(dòng)上皮形成，維持表皮基底層成熟角質(zhì)細(xì)胞的增殖潛力。皮膚microRNA的改變會(huì)引起增殖、分化的錯(cuò)誤信號(hào)，最終導(dǎo)致皮膚疾病的產(chǎn)生。

3 循環(huán)miRNA

3.1 循環(huán)miRNA的來源與檢測(cè)方法

對(duì)于循環(huán)miRNA的來源目前主要觀點(diǎn)有：循環(huán)RNA來自于凋亡或壞死的細(xì)胞，細(xì)胞的主動(dòng)釋放，以及循環(huán)細(xì)胞的裂解.但對(duì)于特定循環(huán)miRNA的真實(shí)來源還存在許多未知的因素。研究表明，內(nèi)源性的循環(huán)RNA分子具有良好的抗RNase降解能力，有較高的穩(wěn)定性。雖然目前機(jī)制還不是很清楚，但并不影響對(duì)其的研究。為了驗(yàn)證內(nèi)源性miRNAs在血漿中的穩(wěn)定性，Mitchell等[17]將血漿放置室溫24h或經(jīng)過8次凍融對(duì)目的基因的量進(jìn)行測(cè)試發(fā)現(xiàn)影響很小，沒有顯著差異，充分證實(shí)了miRNA在血漿中的穩(wěn)定性，具備作為臨床檢測(cè)指標(biāo)的條件之一。

目前對(duì)microRNA的檢測(cè)主要有兩種方法，一是利用microarray芯片，對(duì)基因進(jìn)行篩查，二是利用real-time PCR對(duì)目的基因進(jìn)行相對(duì)定量檢測(cè)，有Taqman探針和SYBgreen法，Taqman探針因其具有特異、敏感和快速優(yōu)于SYBgreen法而逐步成為實(shí)驗(yàn)方法的金標(biāo)準(zhǔn)。由于在血清中miRNA的含量少且其分子量小，因而在進(jìn)行樣本抽提時(shí)不同于普通的RNA抽提。利用mirVana PARIS試劑盒，用等體積酸性酚-氯仿抽提樣品以去除蛋白成分，通過不同梯度100%乙醇的加入達(dá)到對(duì)不同RNA成分的分離最終獲得高濃度的miRNA洗脫液用于下面的逆轉(zhuǎn)錄和定量檢測(cè)。

3.2 循環(huán)miRNA是檢測(cè)的潛在標(biāo)志物

與組織表達(dá)的miRNA一樣，循環(huán)miRNAs首先最廣泛地用于對(duì)腫瘤疾病的研究。在血清中檢測(cè)腫瘤組織中高表達(dá)miRNA并對(duì)其分析來判斷miRNA對(duì)疾病診斷、治療、預(yù)后的檢測(cè)作用。循環(huán)miR-1可作為急性心肌梗死 (acutemyocardial infraction，AMI)的潛在標(biāo)記物，與正常組比較AMI在疾病組的Ct值中值有明顯的差別(CtI=32.11，AMI=28.35)，利用ROC 曲線(receiver–operator characteristic curve，ROC)分析來肯定它的診斷價(jià)值，并且回歸分析miR-1的水平與年齡、性別、高血壓、糖尿病等與AMI有關(guān)的因素都無相關(guān)[18]。miRNA還可用來對(duì)懷孕不同時(shí)段的監(jiān)測(cè)，與未孕對(duì)照組比較孕期第一階段(6～12周)和孕期第三階段(34～41周)let-7d、miR-527、miR-520d5p、miR-526a、miR-141 的表達(dá)隨著孕齡增加而增高，對(duì)胎兒發(fā)育起到監(jiān)測(cè)的作用[19]。

4 展望

通過miRNA檢測(cè)達(dá)到對(duì)疾病的檢測(cè)、治療和預(yù)后的檢測(cè)已經(jīng)是目前關(guān)于RNA研究的熱點(diǎn)，miRNA的表達(dá)有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性，而且在血清或血漿中通過實(shí)驗(yàn)方法可以檢測(cè)量的表達(dá)變化。雖然大部分miRNA的功能和作用機(jī)制還沒有完全清楚，但其在維持機(jī)體健康和疾病監(jiān)控的作用越來越受到關(guān)注。目前蛋白水平檢測(cè)是在轉(zhuǎn)錄翻譯后，而miRNA則通過影響轉(zhuǎn)錄后翻譯達(dá)到調(diào)控，對(duì)疾病的臨床意義更大，并且就當(dāng)前的技術(shù)可以很快地建立起miRNA為系統(tǒng)的檢測(cè)方法，以miRNA為新的檢測(cè)標(biāo)志物的建立是可以期盼的。

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