從靶標的多樣性看核酸適配子在分子識別中的優(yōu)勢與前景

譚新穎，張焜和

（南昌大學第一附屬醫(yī)院 江西省消化疾病研究所，南昌 330006）

從靶標的多樣性看核酸適配子在分子識別中的優(yōu)勢與前景

譚新穎，張焜和*

（南昌大學第一附屬醫(yī)院 江西省消化疾病研究所，南昌 330006）

20世紀90年代初，Tuerk等[1]建立了一種新的組合化學技術——指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進化技術（Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX），篩選到噬菌體T4 DNA聚合酶的RNA配體，即核酸適配子（aptamer）。核酸適配子能與生物靶分子高特異性和高親和力結(jié)合，功能上與抗體類似，在分子識別研究中具有重要價值，目前在生物醫(yī)學各個領域的相關研究中均有應用。SELEX技術自創(chuàng)立以來不斷完善和發(fā)展，所用的篩選靶標從最初的蛋白質(zhì)發(fā)展到目前的小到無機離子和多肽，大到細胞甚至組織，其靶標多樣化程度遠非制備抗體的抗原多樣性可比擬，因而在分子識別中核酸適配子比抗體更具優(yōu)勢，應用前景更為廣闊。本文在簡要介紹SELEX篩選技術及其基本原理的基礎上，就適配子篩選所用的主要靶標類型作一綜述，從中可對適配子的優(yōu)勢和應用前景窺見一斑。

1 SELEX篩選過程及其基本原理

適配子SELEX篩選的基本過程是先人工合成庫容量約1015的隨機單鏈DNA文庫，將其直接或轉(zhuǎn)錄為RNA后與靶標孵育，然后分離結(jié)合核酸并PCR擴增，制備成下一輪與靶標孵育的寡核苷酸文庫。重復若干輪孵育－分離－擴增過程，最后將文庫中能與靶標高特異性及高親和力結(jié)合的單鏈寡核苷酸篩選并富集出來，克隆測序，鑒定其與靶分子結(jié)合的特異性和親和力，選擇能與靶分子高特異性和高親和力結(jié)合者用于靶分子識別的相關研究。

單鏈隨機寡核苷酸文庫中的單鏈寡核苷酸兩端約為20個堿基的固定序列（PCR引物結(jié)合區(qū)），中間為約30個堿基的隨機序列。單鏈寡核苷酸因序列不同，可形成構(gòu)象不同且熱力學上非常穩(wěn)定的二級和三級結(jié)構(gòu)，如發(fā)卡、口袋、假結(jié)、G四聚體等。由于隨機序列的存在，文庫中的單鏈寡核苷酸因序列各異而形成多樣而獨特的空間構(gòu)象，能與靶分子的空間構(gòu)象形成“鎖鑰”關系，并通過氫鍵、疏水結(jié)構(gòu)和離子鍵等與靶分子特異性結(jié)合。理論上，多達1014以上的隨機寡核苷酸文庫幾乎涵蓋了所有可能的立體構(gòu)象，可為自然界存在的所有分子“配型”，找到特異性的核酸配體。

2 分子靶標

2.1 生物小分子

分子量小于10kD的生物小分子可以用作SELEX技術的靶標，篩出相應的適配子。Sassanfar等[2]以 ATP（分子量507.18）為靶標篩選出一組RNA適配子，Huizenga等[3]用ss-DNA文庫也篩選到能與ATP結(jié)合的適配子，Lato等[4]篩選出了硼酸化ATP適配子。放射性核素硼（10B）可釋放中子破壞周圍細胞（范圍為5～9μm，約一個細胞大小），較傳統(tǒng)核素的放療有優(yōu)勢，但目前缺乏10B特異性腫瘤細胞靶向分子，硼酸化ATP適配子可為硼中子的腫瘤靶向化療提供新思路。

激素及神經(jīng)遞質(zhì)多為小分子生物活性物質(zhì)，通過SELEX技術可篩選出它們的核酸適配子。Bruno等[5]篩選得到乙酰膽堿（分子量146.21）的DNA適配子ACh 6R，可有效檢測膽堿能細胞。Lévesque等[6]篩選到甲狀腺素（分子量 776.93）的RNA適配子，能與甲狀腺素(T4)和三碘甲腺原氨素(T3)特異性結(jié)合，但不結(jié)合包括甲腺原氨酸(T0)在內(nèi)的無活性物質(zhì)。Nieuwlandt等[7]成功篩選到一組P物質(zhì)的RNA適配子，它們具有高度保守的二級結(jié)構(gòu)，通過交疊的復雜結(jié)構(gòu)與P物質(zhì)進行緊密結(jié)合。P物質(zhì)是一種含有11個氨基酸的多肽（分子量1.34kD），作為神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)在中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)中起著多種重要作用。上述適配子對于這些小分子生物活性物質(zhì)的含量檢測、功能阻斷具有潛在價值。

2.2 生物大分子 分子量10kD以上的生物大分子是SELEX篩選最常用的靶標，有眾多相關的報道。

2.2.1 體液中的生物大分子 血液及其他體液中含有各種生物大分子，可作為SELEX篩選的良好靶標。血管內(nèi)皮生長因子 （VEGF）是一種分子量為34～50kD的同源二聚體糖蛋白，廣泛分布于各種組織，是促血管生成的重要因素。Jellinek等[8]篩選到一組能與VEGF特異結(jié)合的RNA適配子，親和力達到pM水平，可以抑制VEGF與細胞表面受體結(jié)合。

免疫球蛋白是血液中一類重要的生物大分子，也可作為篩選靶標。Biesecker等[9]篩選到補體C5（分子量190kD）的一組適配子，其中7個與補體C5具有高親和力（解離常數(shù)kd為20～40nM），能有效抑制人血清溶血反應和酵母多糖誘導的C5a產(chǎn)生。他們還在結(jié)構(gòu)分析的基礎上構(gòu)建了一個特定堿基序列的隨機RNA文庫，進行了二次篩選，篩選出具有更高親和力的適配子（解離常數(shù)為2～5nM），這些適配子在人類疾病的治療中具有潛在應用價值。Mendonsa等[10]篩選到人IgE的DNA適配子，平均解離常數(shù)為29nM，能很好地區(qū)分人IgG和鼠IgE。

腫瘤標志物多為蛋白，存在于各種體液中，其核酸適配子的篩選可用于這些標志物的檢測和腫瘤的分子診斷蛋白。MUC1是一種廣泛存在于上皮細胞源性腫瘤的標志物，在腫瘤的診斷與免疫治療中具有潛在應用價值。Ferreira等[11]篩選到一組MUC1的DNA適配子，其檢測低限為1μg/ml，線性范圍在8～100μg/m l，可以滿足研發(fā)MUC1檢測試劑的要求。

2.2.2 細胞膜蛋白 細胞膜上存在大量的蛋白質(zhì)類功能分子，有的與胞膜的物質(zhì)轉(zhuǎn)運功能有關（如離子通道），有的與細胞辨認和接受環(huán)境中特異的化學性刺激有關（統(tǒng)稱受體），有的與細胞的免疫功能有關 （如CD分子）。它們也可作為SELEX篩選的靶標。

Huang等[12]篩選到α-氨基羥甲基惡唑丙酸（AMPA）受體亞型GluR2的一組RNA適配子，具有穩(wěn)定的物理特性，其中適配子AN58可與NBQX（最強的GluR2受體抑制劑）競爭結(jié)合GluR2受體。AMPA受體是一種谷氨酸離子通道亞型，過度激活可導致相應的離子大量內(nèi)流而引起細胞損傷，與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關，上述適配子對研制AMPA受體的水溶性抑制劑以治療相關疾病具有重要價值。Toll樣受體（TLR）家族在宿主抗微生物免疫中具有重要作用，其表達異常與免疫性疾病的發(fā)生關系密切。Chang等[13]篩選出TLR2受體的適配子，其中一個適配子的Kd值僅為73pM，能有效阻斷TLR2，對相關細胞因子分泌水平抑制程度達80%以上，對TLR2功能異常具有潛在的治療價值。

以免疫細胞表面的免疫相關分子為靶標可篩選出調(diào)控免疫功能的核酸適配子。McNamara等[14]篩選到小鼠共刺激分子4-1BB的適配子，在體外能共刺激T細胞活化，體內(nèi)能抑制小鼠的腫瘤生長。Kraus等[15]以重組sCD4為靶標篩選出一組RNA適配子，能敏感而特異地結(jié)合CD4分子，與CD4單抗具有相似的免疫抑制作用。

2.2.3 病原微生物蛋白或產(chǎn)物 因缺乏有效藥物，病毒成為目前對人類健康危害最大的病原微生物，不少研究以病毒的功能蛋白為靶標篩選相應的適配子，以期為病毒的診治提供新的手段。

人免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的Rev蛋白作為一種核質(zhì)穿梭蛋白，對病毒的復制起關鍵作用。Tuerk等[16]篩選出特異性的HIV Rev蛋白的RNA適配子，結(jié)構(gòu)分析顯示適配子的兩個區(qū)域能夠與Rev蛋白特異結(jié)合。Li等[17]篩選到發(fā)生耐藥變異的HIV逆轉(zhuǎn)錄酶的適配子，只特異性結(jié)合變異的逆轉(zhuǎn)錄酶，可用于耐藥變異HIV的檢測和治療。

Lee等[18]以丙型肝炎病毒（HCV）核心抗原為靶標篩選到的RNA適配子只與核心抗原特異性結(jié)合，不與非結(jié)構(gòu)5區(qū)（NS5）蛋白結(jié)合，可用于檢測血清中的HCV核心抗原而診斷HCV感染。Fukuda等[19]篩選的適配子能與HCV非結(jié)構(gòu)蛋白NS3酶活性位點(△NS3)特異性結(jié)合，并能抑制其90%的酶活性，具有潛在治療價值。

人類流感病毒表面表達的血凝素(HA)是決定流感病毒A、B型的關鍵標志，可據(jù)此鑒別病毒亞型，對臨床診斷及流行病學研究十分重要。Subash等[20]成功篩選出B型人類流感病毒的HA特異性適配子，與A型病毒株的HA無結(jié)合能力。Cheng等[21]篩選出禽流感病毒株H5N1的重組體HA1蛋白的一組DNA適配子，其中一個適配子具有較強的親和力且能抑制H5N1病毒復制，為開發(fā)預防禽流感藥物以及控制其傳播提供了新思路。

正常朊病毒蛋白PrP(C)和病態(tài)朊病毒蛋白PrP(Sc)尚缺乏敏感、特異的試劑來區(qū)分。Bibby等[22]應用鼠類朊病毒蛋白質(zhì)重組體為靶標，篩選到24個高親和力的ssDNA適配子，其中4個適配子能特異性與鼠朊病毒蛋白質(zhì)結(jié)合，大多數(shù)同時也能和人和羊的朊病毒蛋白質(zhì)結(jié)合，解離常數(shù)8～79 nM不等，為后續(xù)的朊病毒蛋白的檢測分析奠定了基礎。

結(jié)核桿菌分泌的早期分泌抗原靶6(early secretary antigenic target-6,ESAT-6)在抗結(jié)核分支桿菌感染的免疫應答中起重要作用，可將ESAT-6作為區(qū)分結(jié)核分支桿菌感染和卡介苗接種或環(huán)境分枝桿菌感染的特異性抗原。馬占忠等[23]以ESAT-6為靶蛋白篩選出ssDNA適配子，為結(jié)核病診斷和治療藥物的開發(fā)奠定了基礎。

2.3 化學藥物 化學藥物分子量小，難以制備相應的抗體，但卻可以作為靶標篩選相應的適配子，用于藥物檢測分析。

四環(huán)素類是在四環(huán)素化學基團5,6位碳原子上存在差異的一類抗生素，例如氧四環(huán)素（土霉素）和去氧四環(huán)素（阿霉素）等。Niazi等[24]利用氧四環(huán)素、去氧四環(huán)素和普通四環(huán)素分別做靶標和反篩靶標，篩選出了20個四環(huán)素基團特異的ss-DNA適配子，其中7個對普通四環(huán)素主鏈有較高的親和力（Kd=63～483 nM），對四環(huán)素同型異構(gòu)體的特異性結(jié)合的程度為氧四環(huán)素>四環(huán)素>阿霉素，這種四環(huán)素特異性適配子可用于靶藥物轉(zhuǎn)運和四環(huán)素制備中的檢測及純度分析。

環(huán)孢霉素A(cyclosporin A，CsA)是含11個氨基酸的環(huán)狀多肽，為器官移植后臨床常用的免疫抑制劑，有較嚴重的肝、腎毒性，故定期監(jiān)測病人血液中CsA的濃度，對減少或避免毒副反應、保證療效、提高移植病人的存活率至關重要，但傳統(tǒng)的熒光偏振免疫法和高效液相色譜法檢測存在著成本高等問題，李衛(wèi)濱等[25]篩選到針對CsA的ssDNA特異性適配子，為建立檢測血液CsA濃度的快速而簡便檢測方法奠定了基礎。

3 微生物靶標

完整的病毒顆粒、細菌都可以是適配子篩選的靶標，可同時篩出與多個位點結(jié)合的適配子，是一種高效的復合篩選。Nitsche等[26]以牛痘病毒為靶標篩選出DNA適配子，能抑制牛痘病毒及其他痘科病毒感染，具有濃度依賴性。Chen等[27]篩選到結(jié)核菌株 (H37Rv)的高親和力和高特異性適配子NK2，與H37Rv結(jié)合后可只促進CD4+T細胞分泌IFN-γ；體內(nèi)注射NK2可使感染H37Rv小鼠的壽命明顯延長，脾臟的細菌數(shù)明顯減少，肺組織的肺泡融合和腫脹減輕。甄蓓等[28]以炭疽芽孢桿菌疫苗株A.16R芽孢為靶標，篩選獲得的適配子文庫的親和力是原始文庫的37倍，二級結(jié)構(gòu)分析顯示這些適配子通過5’端的莖-環(huán)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)與靶標結(jié)合，而臨近堿基的三級結(jié)構(gòu)則維持其穩(wěn)定性，有可能成為一種有效的炭疽桿菌的分子診斷工具。還有人篩選出葡萄球菌、淋病奈瑟菌等其它細菌適配子。

4 真核細胞靶標

以活的真核細胞為靶標，可進行所謂的Cell-SELEX，篩選出細胞表面分子的適配子。Cell-SELEX具有簡單、高效、直接、可重復等特點，最大的優(yōu)點是無需特定靶分子的相關知識，因而在惡性腫瘤的診斷及生物標志物研究方面具有良好的前景。目前主要以腫瘤細胞為靶標進行此類篩選。

白血病細胞以單細胞狀態(tài)存在于血液中，是Cell-SELEX的理想靶標。Shangguan等[29]用人類急性T淋巴細胞性白血病(T-ALL)的CCEF-CEM細胞株作為靶細胞，人類B細胞系淋巴瘤CRL-1596細胞株為陰性細胞（反篩），篩選出一組核酸適配子，能夠特異地識別靶細胞，而不與正常造血細胞、淋巴瘤和骨髓瘤細胞結(jié)合。他們在對適配子的后續(xù)分析中，發(fā)現(xiàn)白血病細胞高表達跨膜蛋白——蛋白酪氨酸激酶 7 (PTK7)，并認為是T-ALL的特異性生物標記物[30]。

實體瘤細胞也可作為Cell-SELEX篩選的靶標。Chen等[31]以小細胞肺癌細胞為靶標篩選到的多個適配子，能高親和力和高特異性結(jié)合不同來源的肺癌細胞（包括來自于肺癌標本者）；將適配子與磁性熒光納米粒聯(lián)結(jié)后，可從含有混合細胞的培養(yǎng)基中分離、富集和敏感地檢測靶細胞。Shangguan等[32]以源于小鼠肝細胞的MEAR肝癌細胞系靶標，用BNL肝細胞系進行消減篩選（MEAR由BNL經(jīng)化學誘導而得），獲得納摩水平親和力的肝癌細胞株MEAR的特異性適配子，能在小鼠模型中與肝癌細胞特異性結(jié)合。這項結(jié)果提示癌細胞特異性適配子將有可能成為體內(nèi)診斷與治療的靶向分子。

5 結(jié)束語

核酸適配子與抗體相似，都可用于靶分子的識別，且敏感性和特異性有時好于抗體。在兩者的制備過程中，核酸適配子在靶標上有明顯的優(yōu)勢。篩選適配子的靶標可以小到無機分子，大到完整的活細胞，甚至組織[33]，而制備抗體的靶標主要為蛋白質(zhì)，且必須具有免疫原性，但不能有毒。相比之下，兩者所針對的靶分子范圍相差甚遠。不僅如此，核酸適配子的制備過程本身也較抗體更簡單、不需要體內(nèi)過程、耗時更短、可人工合成。此外，從適配子與抗體之間理化性質(zhì)的差異也可看到核酸適配子的優(yōu)勢，如性質(zhì)穩(wěn)定、無免疫原性、分子量較小。因而核酸適配子的篩選與應用研究已應用于醫(yī)學的各個領域，如基礎研究、臨床診斷、疾病治療和藥物研發(fā)等方面?？梢灶A見，核酸適配子的篩選靶標會進一步豐富，所涉及的領域會進一步擴展，在醫(yī)學中應用前景會更加廣闊。

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Q74

B

1674-1129(2010)02-0161-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2010.02.023

江西省科技攻關項目（20061B03032400）；江西省衛(wèi)生廳重大指標項目 （20074001）；江西省教育廳科技項目（2006061）；江西省研究生創(chuàng)新基金項目（YC07A022）

*通訊作者