腦衰老與認知障礙的研究進展

崔德華

腦衰老與大腦功能和人體老化有關(guān),衰老是人類生命過程的必然規(guī)律,神經(jīng)系統(tǒng)是重要的機能調(diào)節(jié)系統(tǒng),也是受衰老影響最大的系統(tǒng)之一,衰老的腦組織會產(chǎn)生一些特征性的改變,了解腦衰老分子機制對老年認知障礙的研究具有重要意義。

1 腦衰老特征性變化

隨著年齡增長,神經(jīng)元內(nèi)沉積脂褐質(zhì)(老年色素,lipofuscin)為腦衰老特征性金標準。未進行特殊染色也可在光鏡和熒光顯微鏡下觀察到神經(jīng)元內(nèi)顆粒狀脂褐質(zhì)。造成神經(jīng)元蓄積脂褐質(zhì)的主要原因是出現(xiàn)交聯(lián)物質(zhì)增生和積聚,某些離子化的分子基團,在生命的早期有其正常代謝和排出途徑,老年期這種代謝和排出逐漸減慢并在體內(nèi)積聚。脂褐質(zhì)大部分來自線粒體,是由不飽和脂肪過氧化物形成的交聯(lián)體。由于這種交聯(lián)體分子量大,不易從細胞內(nèi)排出,在神經(jīng)元內(nèi)沉積,尤以大腦皮質(zhì)和海馬部位為著,是迄今唯一較為明確而公認的正常衰老標志。無論上述交聯(lián)物質(zhì)的積聚,或是異常糖基化或自由基的過量生成,最終都能使蛋白質(zhì)的質(zhì)和量發(fā)生變化,引起生物膜的通透性、受體結(jié)構(gòu)、酶的催化功能改變,引起正常生化代謝減慢或停滯,出現(xiàn)脂褐質(zhì)積聚[1-2]。

2 腦衰老基因

2.1 Klotho基因 是最初發(fā)現(xiàn)的腦衰老基因,該基因斷裂可使小鼠表現(xiàn)出類似人類早衰的癥狀,如活動減少、生育能力喪失、骨質(zhì)疏松、動脈硬化等,并且通過研究發(fā)現(xiàn),將正常的 Klotho蛋白注入表達內(nèi)源性 Klotho基因的器官,可以改善全身性衰老癥狀,因此認為 Klotho蛋白本身就是一種抗衰老體液因子。

2.2 衰老相關(guān)基因

2.2.1 早老素基因:(1)早老素基因突變與細胞內(nèi) Aβ:1995年,筆者所在的實驗室世界首次發(fā)現(xiàn)了家族性阿爾茨海默病(FAD)患者的S182突變基因 (現(xiàn)稱為 PS1-H163R)。此后筆者提出了獨自的細胞內(nèi)蓄積 Aβ42可發(fā)生阿爾茨海默病(AD)的學說,發(fā)現(xiàn)了早老素 1(presenilin1,PS1)基因突變的腦組織沒有形成老年斑階段,細胞內(nèi)蓄積的 Aβ42可以促進神經(jīng)細胞的變性脫落,并且可引起 AD發(fā)病的論據(jù),引發(fā) AD的研究引起研究者的極大關(guān)注。1998年,筆者進行了PS1對細胞骨架蛋白相互關(guān)系的研究,首次發(fā)現(xiàn) PS1-C與神經(jīng)元纖維纏結(jié)(NFT)結(jié)合,PS基因通過調(diào)控Notch信號傳導從而調(diào)控其裂解過程,參與APP的代謝。PS基因的突變使 Aβ產(chǎn)生增多,神經(jīng)元內(nèi)沉積脂褐質(zhì)并對凋亡的易患性也增加,成為已證實的腦衰老基因[3]。

(2)早老素基因突變與 Tau蛋白:隨著增齡腦內(nèi)激酶活性增高或磷酸酶活性降低可引起 Tau蛋白過磷酸化導致出現(xiàn) NFT,腦內(nèi)大量出現(xiàn)NFT是 AD的重要病理特征之一,但早老素基因突變與 NFT的關(guān)聯(lián)尚不清。筆者首次發(fā)現(xiàn) Tau蛋白的過磷酸化所產(chǎn)生的 NFT與早老素有關(guān)聯(lián),2005年首次發(fā)現(xiàn)早老素促進糖原合成酶激酶 -3β(GSK-3β)活性,導致Tau蛋白的過磷酸化[4-5]。

2.2.2 死亡因子-4(morf-4):1997年在人的 4號染色體的一個小片段上,發(fā)現(xiàn)一個稱做死亡因子-4(mortality factor-4)或稱為 morf-4的基因,由 morf-4基因所編碼的蛋白質(zhì)可能幫助細胞監(jiān)控它們的端粒長度,從而達到調(diào)控衰老的目的。此外,還有 ced-3、ced-4及白介素-1基因激活也可誘發(fā)細胞程序性死亡?，F(xiàn)在已有大量研究認為,細胞程序性死亡參與 AD的發(fā)病過程[6-7]。

2.2.3 Werners、 p21、 p16INK 4:該Werners基因?qū)塍w外培養(yǎng)的成纖維細胞株表現(xiàn)提早衰老。p21(又稱 WAF1或 CIP1)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在衰老細胞中較年輕細胞增高,相應(yīng)p21蛋白含量也升高,并且在年輕細胞中 p21過量表達可抑制細胞周期的進程,提示 p21基因是衰老基因。p16INK4在衰老成纖維細胞中,其蛋白水平較年輕細胞高,并且在永生細胞系中常突變或缺失,故認為 p16INK4也是衰老基因[8-9]。

2.2.4 clk、daf-2:有研究發(fā)現(xiàn) ,線蟲(caenorhabditis elegans)的壽限與 clk基因以及 daf家族的 daf-2基因相關(guān)。daf基因編碼與蠕蟲發(fā)育相關(guān)傳遞途徑中某些蛋白分子的基因,而 clk則通過影響染色體的結(jié)構(gòu)和功能起作用,它們又稱生物鐘基因,二者均是與衰老相關(guān)的基因[10-12]。

3 腦衰老機制

衰老是一種多因素、多器官參與的綜合性現(xiàn)象,近年來衰老領(lǐng)域研究進展的一個重要部分是有關(guān)衰老表觀遺傳調(diào)控的,這一領(lǐng)域的進展對延緩衰老和抗衰老研究具有重要的科學價值,現(xiàn)將這一領(lǐng)域的最新進展講述如下。

3.1 異常糖基化學說 非酶糖基化是指體內(nèi)蛋白質(zhì)中氨基與還原糖的羰基在無酶條件下發(fā)生的反應(yīng),其高級階段形成不溶性、不被酶降解的交聯(lián)體,稱晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end-products,AGEs)。AGEs可通過作用于細胞受體來影響細胞功能,改變多種細胞因子的表達水平,產(chǎn)生病理生理作用。除信號轉(zhuǎn)導機制外,堆積在老年斑附近的 AGEs可直接加速氧化應(yīng)激,破壞谷胱甘肽還原狀態(tài)。AGEs陽性的小膠質(zhì)和星形膠質(zhì)細胞在AD患者的腦組織大量表達 iNOS,并在成熟的老年斑周圍誘導氧化應(yīng)激?，F(xiàn)代科學認為自由基反應(yīng)異常是衰老過程中細胞損害的主要原因,細胞內(nèi)脂褐質(zhì)的沉積是細胞膜系統(tǒng)發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物,衰老的神經(jīng)細胞內(nèi)脂褐質(zhì)明顯增多,當在細胞內(nèi)積聚到一定程度,會造成核糖核酸的損害,最終將影響細胞的代謝導致細胞死亡。目前已經(jīng)公認,脂褐質(zhì)是細胞衰老過程中具有的特征性物質(zhì),神經(jīng)元內(nèi)脂褐質(zhì)蓄積是神經(jīng)系統(tǒng)老化的標志之一[13-15]。

3.2 自由基與線粒體衰老學說衰老學說中最有影響力的學說就是1956年美國學者 Harman提出的自由基學說,自由基是人體正常的代謝產(chǎn)物,正常情況下人體內(nèi)的自由基處于不斷的產(chǎn)生與消除的動態(tài)平衡中,一旦數(shù)量過多會引起生物大分子如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸的損傷。1980年,Miquel和 Cowoker提出衰老的線粒體假說,認為線粒體的損傷是細胞衰老和死亡的分子基礎(chǔ)。線粒體是產(chǎn)生自由基的最主要的亞細胞器,過量的自由基損傷線粒體,影響呼吸功能并且由此增加電子流和活性氧生成,加重氧化應(yīng)激和線粒體氧化損傷,在活性氧生成和線粒體 DNA(mtDNA)氧化損傷和突變間形成了惡性循環(huán)。過多的自由基能造成多種 DNA損傷,如染色體移位、DNA單雙鏈斷裂、DNA片段缺失,都隨年齡積累。DNA、RNA變化最明顯的部位是上顳回、前中央回、紋狀體、腦干黑質(zhì)及藍斑海馬等。m tDNA比核 DNA更易遭受氧化損傷,損傷程度高,mtDNA的突變是一個很好的衰老生物學指標。有關(guān)檢測 mtDNA突變的實驗結(jié)果顯示:在停止分裂的組織細胞中,m tDNA的多種突變隨年齡呈指數(shù)增加。mtDNA突變以片段缺失最普遍,帕金森病、AD等老年常見病都與 mtDNA片段缺失有關(guān)。氧在代謝過程中產(chǎn)生的多種性質(zhì)活潑的自由基能使生物膜發(fā)生脂質(zhì)過氧化,生成脂質(zhì)過氧化物 (LPO),LPO可以分解產(chǎn)生丙二醛(MDA),MDA是一種有害物質(zhì),它可以引起多種生化毒性反應(yīng),形成老年斑、脂褐質(zhì)等異常代謝產(chǎn)物,造成機體衰老和多種疾病。此外,自由基也能造成蛋白質(zhì)和糖類的損傷。隨著自由基生物學的發(fā)展,在自由基學說基礎(chǔ)上提出了很多新理論和假說,如自由基氧化-非酶糖基化衰老學說,提出羰基毒化是自由基和非酶糖基化反應(yīng)衰老機制的共同核心過程,1993年英國的 Wolff博士根據(jù)他的研究結(jié)果提出了“糖基氧化”(glycoxidation),實驗證明與氧自由基相關(guān)的氧化過程確實加速和促進了糖基化反應(yīng)的作用[16-18]。

3.3 氧化衰老和胰島素受體信號轉(zhuǎn)導 腦內(nèi)胰島素主要來自外周,少量由局部(例如海馬、額葉前皮質(zhì)等)分泌。胰島素在腦內(nèi)主要分布于神經(jīng)元,胰島素受體蛋白密集在海馬 CAI區(qū)的錐體細胞軸突、下丘腦腎上腺素能神經(jīng)元末端及嗅球的樹—樹突觸小體的細胞膜表面,在與認知密切相關(guān)的皮質(zhì)腦區(qū)表達豐富。對神經(jīng)元來說磷脂酰肌醇激酶(PI3K)是胰島素作用的關(guān)鍵因素,研究表明 PI3K在參與神經(jīng)元存活的途徑中,PI3K/蛋白激酶 B(Akt)途徑非常重要,PI3K/Akt的活化能夠抑制神經(jīng)元的凋亡,而當 PI3K/Akt不表達時則不能抑制凋亡。目前已經(jīng)明確,胰島素的神經(jīng)保護作用主要通過Akt和 GSK-3β信號通路,胰島素能激活 PI3K/Akt通路,抑制 GSK-3β信號通路。Hutter等在體外培養(yǎng)人神經(jīng)細胞觀察到,外周胰島素水平下降可以抑制 PI3K的活性,而 PI3K可通過自身活性下降來導致下游的 GSK-3β由非活化型轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨?從而 Tau蛋白發(fā)生磷酸化,而 Tau蛋白的過度磷酸化是AD最早出現(xiàn)的病理改變。上述研究均說明,胰島素是一種神經(jīng)保護劑,通過調(diào)節(jié)氧化防御、調(diào)節(jié)神經(jīng)代謝、抗凋亡等對抗神經(jīng)退行性變疾病相關(guān)的氧化應(yīng)激。此外,參與神經(jīng)系統(tǒng)胰島素抗衰老的還有細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2通路,且在 PI3K/Ak t和 ERK1/2通路間存在交叉[19-21]。

3.4 糖及脂類代謝異常 糖代謝及脂類代謝異?？梢鹉X衰老,同時促進認知障礙的發(fā)生。我們跟北京大學心血管研究室合作研究首次發(fā)現(xiàn)脂蛋白脂肪酶缺陷可引起神經(jīng)突觸小胞減少,導致認知障礙。研究結(jié)果提示,脂類代謝異?？纱龠M腦衰老認知障礙。

4 腦衰老認知障礙與表觀遺傳學

4.1 表觀遺傳學 表觀遺傳學(epigenetics)是研究表觀遺傳變異的遺傳學分支學科。表觀遺傳變異是指,在基因的 DNA序列沒有發(fā)生改變的情況下,基因功能發(fā)生了可遺傳的變化,并最終導致了表型的變化。從目前的研究來看,X染色體劑量補償、DNA甲基化、組蛋白密碼、基因組印記、表觀基因組學和人類表觀計劃等問題都是表觀遺傳學研究的內(nèi)容[22]。

4.1.1 X染色體失活:在哺乳動物中,雌雄性個體 X染色體的數(shù)目不同,這類動物需要以一種方式來解決 X染色體劑量的差異。在雌性哺乳動物中,兩條 X染色體有一個是失活的,稱為 X染色體的劑量補償(dosage compensation)。X染色體失活的選擇和起始發(fā)生在胚胎發(fā)育的早期,這個過程被 X失活中心(X-inactivation center,Xic)所控制,是一種反義轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。這個失活中心存在著 X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄基因 Xist,當失活的命令下達時,這個基因就會產(chǎn)生一個17 kb不翻譯的 RNA與 X染色體結(jié)合,引發(fā)失活。X失活中心還有“記數(shù)”的功能,即保持每個二倍體中僅有一條 X染色體有活性,其余全部失活。X染色體的失活狀態(tài)需要表觀遺傳修飾如 DNA甲基化來維持。這種失活可以通過有絲或減數(shù)分裂遺傳給后代。X染色體失活是表觀遺傳學研究的很好范例,它能幫助人們認識基因沉默是如何建立和通過遺傳而保持的。今后對于X染色體失活的研究還要特別關(guān)注于哪些因素調(diào)控了 Xic的功能、XistRNA造成沉默的機制和一些像BRCAl的蛋白質(zhì)在 X染色體失活中的作用等問題[23]。

4.1.2 DNA甲基化:甲基化是基因組 DNA的一種主要表觀遺傳修飾形式,是調(diào)節(jié)基因組功能的重要手段。在脊椎動物中,CpG二核苷酸是DNA甲基化發(fā)生的主要位點。CpG常成簇存在,人們將基因組中富含 CpG的一段 DNA稱為 CpG島(CpGisland),通常長度在 1～2 kb左右。CpG島常位于轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)附近,DNA甲基化的研究與 CpG島的研究密不可分。在 DNA甲基化過程中,胞嘧啶突出于 DNA雙螺旋并進入與胞嘧啶甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)合部位的裂隙中,該酶將 S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5′位,形成 5-甲基胞嘧啶 (5-methylcytosine,5MC)。體內(nèi)甲基化狀態(tài)有 3種:持續(xù)的低甲基化狀態(tài),如持家基因;誘導的去甲基化狀態(tài),如發(fā)育階段中的一些基因;高度甲基化狀態(tài),如女性的一條縊縮的 X染色體。DNA甲基化主要是通過 DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族(DNA methyltransferase,Dnmt)來催化。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶分為 2種:一種是維持甲基化酶 Dnmtl;另一種是重新甲基化酶如 Dnmt3a和 Dnmt3b,它們使去甲基化的 CpG位點重新甲基化。在細胞分化的過程中,基因的甲基化狀態(tài)將遺傳給后代細胞。但在哺乳動物的生殖細胞發(fā)育時期和植入前胚胎期,其范圍內(nèi)的甲基化模式通過大規(guī)模的去甲基化和接下來的再甲基化過程發(fā)生重編程,從而產(chǎn)生具有發(fā)育潛能的細胞[23]。

4.1.3 組蛋白密碼:染色體的多級折疊過程中,需要 DNA同組蛋白(H3、H4、H2A、H2B和 H1)結(jié)合在一起。研究中,人們發(fā)現(xiàn)組蛋白在進化中是保守的,但它們并不是通常認為的靜態(tài)結(jié)構(gòu)。組蛋白在翻譯后的修飾中會發(fā)生改變,從而提供一種識別的標志,為其他蛋白與DNA的結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同或拮抗效應(yīng),它是一種動態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)控成分,稱為組蛋白密碼(histone code)。這種常見的組蛋白外在修飾作用包括乙?；?、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等等,它們都是組蛋白密碼的基本元素。與DNA密碼不同的是,組蛋白密碼和它的解碼機制在動物、植物和真菌類中是不同的。我們從植物細胞保留有發(fā)育成整個植株的全能性和去分化的特性中,就可以看出它們在建立和保持表觀遺傳信息方面與動物是不同的。在組蛋白的修飾中,乙?；?、甲基化研究最多。乙?；揎棿蠖嘣诮M蛋白 H 3的 Lys9、14、18、23和 H4的 Lys5、8、12、16等位點。對這兩種修飾結(jié)果的研究顯示,它們既能激活基因也能使基因沉默。甲基化修飾主要在組蛋白H3和 H4的賴氨酸和精氨酸兩類殘基上[23]。

4.1.4 印記:人們在研究中發(fā)現(xiàn),來自雙親的某些等位基因,在子代的表達不同,由于源自某一親本的等位基因或它所在染色體發(fā)生了表觀遺傳修飾,導致不同親本來源的兩個等位基因在子代細胞中表達不同。在基因組中的這類現(xiàn)象就是基因組印記(genomic imprinting)。

印記基因在發(fā)育過程中扮演重要的角色,它們一般在染色體上成簇分布。在小鼠和人體中已知有80多種印記基因。等位基因的抑制(allelic repression)被印記控制區(qū)(imprinting control regions,ICRs)所調(diào)控,該區(qū)域在雙親中的一個等位基因是甲基化的。ICR在不同區(qū)域中對印記的調(diào)控存在差異。在一些區(qū)域中,未甲基化的 ICR組成一個絕緣子阻止啟動子和增強子間的相互作用;在其他區(qū)域中,可能有非編碼 RNA(non-coding RNAs)的參與,這種沉默機制與 X染色體失活相似。在配子形成時期,非組蛋白和附近的序列單元可以影響到差異甲基化的建立。在基因印記維持的研究中,人們注意到表觀印記的反常可能在人體中導致復(fù)雜的疾病。一些環(huán)境因素,比如食物中的葉酸也會破壞印記。人們知道環(huán)境可以影響到由遺傳因素所決定的表型[23-24]。

4.2 表觀遺傳在腦衰老中所起的作用 近年來衰老領(lǐng)域取得了令人鼓舞的進展,其中一個重要方面就是衰老的表觀遺傳學,包括表觀遺傳在細胞和器官衰老中的角色。有一些實驗證據(jù)顯示表觀遺傳改變在細胞和器官衰老中起關(guān)鍵決定作用,研究人員發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)重塑的失衡會啟動增殖細胞和組織的不可逆生長停滯,使用針對特異染色質(zhì)重塑酶的藥物可以發(fā)展預(yù)防和減少一些衰老相關(guān)疾病發(fā)生的治療方法。衰老的表觀遺傳失調(diào)節(jié),幾種與衰老相關(guān)分子的表觀遺傳學,如PASG、EZH2、PcG和端粒酶等表觀遺傳調(diào)控腦衰老,這一領(lǐng)域的進展對延緩衰老和抗衰老研究具有重要的科學價值。

4.3 表觀遺傳在認知障礙中所起的作用 認知障礙疾病中,以 AD為常見,AD是多基因有關(guān)的疾病,NFT、膽堿能神經(jīng)元丟失、老年斑等為其主要病理特征。該病以 β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚集在神經(jīng)細胞內(nèi)影響神經(jīng)突觸傳遞功能乃至神經(jīng)細胞凋亡并引起認知障礙為特征,其中家族遺傳性占 5%～10%,而絕大多數(shù)的 AD是屬散發(fā)性與表觀遺傳有關(guān)[23]。

飲食、遺傳基因多態(tài)性和環(huán)境中的化學物質(zhì)的作用,均可導致DNA的甲基化狀態(tài)改變。飲食中的蛋氨酸和葉酸是 DNA甲基化甲基基團的供體。如果飲食中缺乏葉酸、蛋氨酸或硒元素,就會改變基因的甲基化狀態(tài),因此環(huán)境因素和個體遺傳特性共同作用,決定了潛在的表觀遺傳疾病的危險性。例如缺乏葉酸和維生素 B12可導致高濃度的總同型半胱氨酸和DNA甲基化異常,促使 AD的發(fā)生。大腦中蛋氨酸/同型半胱氨酸代謝中葉酸和維生素 B12是必不可少的輔助因子。以 N5-甲基四氫葉酸為甲基的供體,維生素 B12為輔因子,在蛋氨酸合成酶催化下,再甲基化形成蛋氨酸,或以甜菜堿為甲基供體,在甜菜堿 Hey甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成蛋氨酸,其中 N5-甲基四氫葉酸是在N5,N10-亞甲基四氫葉酸還原酶(N5,N10-methylenetetrahy drofolatc reductase,MTHFR)催化下,通過葉酸循環(huán)生成的。近年來,伴隨同型半胱氨酸(Hcy)在腦部疾病中的研究日益增多,研究者發(fā)現(xiàn),Hcy血漿水平可能與 AD的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系,高 Hcy血癥是 AD獨立的且強有力的危險因素。在排除了AD的一般危險因素后,隨著 Hcy的濃度升高,AD的患病風險逐漸增加。研究發(fā)現(xiàn) AD病人高血漿Hcy水平促進了神經(jīng)退行性變,并且一旦這些病理過程被誘發(fā),血漿Hcy水平將會獨立于生理性年老所誘發(fā)的水平升高。關(guān)于 Hcy如何參與 AD致病過程目前還未明了。但一些研究提示了 Hcy在 AD病理過程中可能發(fā)揮作用。Rima Obeid等發(fā)現(xiàn) Hcy缺乏將會導致甲基化和(或)氧化還原過程紊亂,進而促進 Ca2+內(nèi)流,淀粉樣蛋白和 Tau蛋白積聚,進而造成細胞凋亡和神經(jīng)元死亡。Hcy的這些作用可能是通過激活 N-methyl-D-aspartate受體亞型來介導的。Hcy的神經(jīng)毒性可以被葉酸、谷氨酸受體拮抗劑或其他抗氧化劑來阻斷。將外源性 Hcy與 Aβ(1-40)結(jié)合,發(fā)現(xiàn)會促進后者在離體和在體兩種條件下 β-sheet構(gòu)象形成,進而促進 β-纖維形成和產(chǎn)生神經(jīng)毒性,提示了 Aβ在腦內(nèi)的活動會被異常代謝信號如胞外高 Hcy水平影響,成為 Hcy參與 AD發(fā)病的一個可能機制。這一研究提示了Hcy神經(jīng)毒性的新機制,揭示了Hcy在 AD發(fā)生過程中具有一定的作用,并且為未來的藥物開發(fā)提供了新的方向。

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