體細胞克隆牛產(chǎn)品安全分析

華松，蘭杰，宋永利，魯成龍，張涌

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100

綜 述

體細胞克隆牛產(chǎn)品安全分析

華松，蘭杰，宋永利，魯成龍，張涌

西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100

體細胞克隆技術(shù)是將已分化的體細胞移到去核的成熟卵母細胞中，通過體外激活和培養(yǎng)，再移植入受體母畜子宮內(nèi)，繁殖出具有相同基因型后代的一種技術(shù)。該技術(shù)可以大幅提升繁殖效率，并提供高質(zhì)、充足和營養(yǎng)豐富的動物食品。近年來，美國、日本和歐洲等國家相繼宣布體細胞克隆動物食品可以上市。然而，目前體細胞克隆效率相當(dāng)?shù)拖?，即使是出生的克隆動物也往往伴隨發(fā)育畸形或高死亡率等現(xiàn)象，在對克隆動物發(fā)育異常知之甚少的情況下，宣布克隆動物產(chǎn)品上市是否為時過早？以下綜述了克隆牛肉、奶及其產(chǎn)品安全。

食品安全，體細胞克隆，牛

Abstract:Somatic cell cloning (nuclear transfer) is a technique through which the nucleus (DNA) of a somatic cell is transferred into an enucleated oocyte for the generation of a new individual, genetically identical to the somatic cell donor. It could be applied for the enhancement of reproduction rate and the improvement of food products involving quality, yield and nutrition. In recent years, the United States, Japan and Europe as well as other countries announced that meat and milk products made from cloned cattle are safe for human consumption. Yet, cloned animals are faced with a wide range of health problems, with a high death rate and a high incidence of disease. The precise causal mechanisms for the low efficiency of cloning remain unclear. Is it safe that any products from cloned animals were allowed into the food supply? This review focuses on the security of meat, milk and products from cloned cattle based on the available data.

Keywords:food safety, somatic cell cloning, bovine

1 世界各國對克隆動物食品的看法

2008年 1月15日，美國食品和藥物管理局宣布，克隆牛、豬和山羊以及它們的后代均可以安全食用，克隆牛奶也可安全食用。歐洲食品安全局科學(xué)委員會宣布除牛和豬外，其他一些克隆動物食品的安全性依然不能確定，需要進一步研究。由東京大學(xué)等單位組成的科研小組認為雖然克隆牛流產(chǎn)和出生后死亡的比例較高，但是，許多克隆牛都能順利成長，更沒有發(fā)現(xiàn)來自克隆牛的蛋白質(zhì)產(chǎn)生新的毒性和病原性物質(zhì)[1]。因此，宣布來自克隆動物食品不存在安全問題，可以放心食用。巴西、澳大利亞、新西蘭等國也先后批準了克隆食品上市。然而，2008年初，法國農(nóng)業(yè)部長貝尼耶明確表示不會吃克隆動物食品。與此同時，德國農(nóng)業(yè)部長澤霍費爾稱，對于克隆動物產(chǎn)品進入食品市場，應(yīng)持非常謹慎的態(tài)度。

實際上，即使允許克隆動物肉或乳制品上市，出售的也多是克隆動物的第1代或第2代的肉、乳制品，克隆動物本身不會被屠宰而制成食品出售，因為克隆動物數(shù)量少、成本高。美國現(xiàn)有克隆牲畜不足2 000頭。而克隆牲畜的平均花費在0.6～1.5萬美元左右。克隆一頭牛要1.75萬美元，一頭豬為0.4萬美元。現(xiàn)在，一頭克隆牛的售價高達8.2萬美元，而一頭普通牛的售價不到0.1萬美元[2]?？寺∈称分饕莵碜钥寺游锝?jīng)過有性繁殖的后代，盡管克隆動物最初是以繁殖為目的，而提供高質(zhì)、高產(chǎn)的動物產(chǎn)品才是大家最關(guān)注的問題[3]。

在我國，盡管國務(wù)院設(shè)立了食品安全委員會，將食品安全提到了國家管理的高度，但對克隆動物食品安全方面還沒有相關(guān)的標準出臺。由于我國動物產(chǎn)品生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)分屬不同部門管理，因此距離正式宣布相關(guān)的安全標準還有相當(dāng)?shù)木嚯x。

2 克隆動物產(chǎn)品的安全性

克隆過程中，通過表觀重編程，將分化的體細胞核恢復(fù)到胚胎細胞的多能狀態(tài)，也就是細胞核在卵母細胞體系中恢復(fù)到類似受精卵的狀態(tài)，這一過程中經(jīng)常出現(xiàn)各種錯誤[4-5]。這些錯誤不利于胚胎的發(fā)育，且有害于動物出生后的健康。體細胞克隆效率低下，圍產(chǎn)期死亡率高是異常的重編程所致。來自那些看似健康而實際上有潛在生理缺陷的克隆動物的產(chǎn)品食用后是否不利于身體健康才是最擔(dān)憂的問題[6]。經(jīng)過生物學(xué)假設(shè)和試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)克隆動物后代經(jīng)過有性繁殖可能消除表觀遺傳帶來的缺陷[2,7]。但這是否是普遍的生物學(xué)現(xiàn)象還有待于進一步考證。

2.1 克隆牛生長繁殖性能

Heyman等利用 3年時間對 37頭克隆牛和 38頭普通牛及其產(chǎn)品進行監(jiān)測，所有試驗均在繁殖能力、性別、年齡及飼養(yǎng)條件相同的情況下進行。發(fā)現(xiàn)克隆牛到達初情期的時間比普通牛平均要晚62 d，且體重平均為56 kg，顯著高于普通牛[8]。同時發(fā)現(xiàn)克隆牛初情期明顯延長[1]。本實驗室2009年體細胞克隆的荷斯坦奶牛初生重均在52～58 kg之間，均為人工助產(chǎn)，否則妊娠期延長。而國內(nèi)陸東林等[9]報道了12頭荷斯坦克隆母牛的生長發(fā)育、配種繁殖和生產(chǎn)性能狀況。發(fā)現(xiàn)克隆牛的平均初生、6月齡、18月齡和初產(chǎn)后體重分別達41.6、191.8、520.8和651.1 kg；第1次配種月齡為16.7個月，受孕月齡為19.2個月，產(chǎn)犢月齡為28.6個月?？寺∨ＩL發(fā)育和產(chǎn)奶量指標均略高于普通牛，但產(chǎn)間距比普通牛長。然而，郝少強等[10]通過對5頭體細胞克隆母牛及其同期自然繁殖出生的荷斯坦母犢牛觀測，發(fā)現(xiàn)克隆牛初生體重和 6月齡體重明顯低于自繁奶牛；克隆牛初生體尺指標明顯大于自繁奶牛，6月齡體尺指標明顯小于自繁奶牛，12月齡體尺指標與自繁奶牛相當(dāng)；克隆牛 0～6月齡期間體尺平均增長明顯低于自繁奶牛，6～12月齡期間體尺平均增長明顯高于自繁奶牛，0～12月齡期間體尺平均增長明顯低于自繁奶牛。這是迄今報道的體細胞克隆牛出生重低于普通牛的唯一資料。但是，由于各地荷斯坦奶牛品系和研究條件等的差異，目前還無法得出克隆牛生長繁殖的普通規(guī)律。

2.2 泌乳量及乳質(zhì)分析

Norman等對克隆牛和普通牛的產(chǎn)奶量進行研究發(fā)現(xiàn)，在泌乳量方面無明顯差異，兩者的泌乳曲線相似[11-12]。對此，Tian等經(jīng)過對比克隆牛與供體細胞牛的 1 000個奶樣，繪制曲線，發(fā)現(xiàn)試驗組和對照組的泌乳曲線非常相似。哺乳期的第 1個月產(chǎn)奶量上升，之后正常地下降?？寺∨Ｔ诘?1個哺乳期和普通牛產(chǎn)奶量差異不顯著 (9 378.4 kg vs.8 990.7 kg，P＞0.05)[13]。Walsh等比較了年齡和泌乳階段相同的克隆奶牛和普通牛乳的構(gòu)成，試驗過程中為了生物安全，將普通牛和克隆牛放養(yǎng)在不同的農(nóng)場。分析了一個泌乳期內(nèi)17頭克隆牛和6頭普通牛 (3個品種荷斯坦、瑞士褐牛、荷斯坦-澤西種乳牛雜交后代的5個品系) 乳汁中總固形物、脂肪、脂肪酸、乳糖和蛋白的含量，未發(fā)現(xiàn)明顯差異[11]。此外，Tian等[13]也發(fā)現(xiàn)克隆牛的奶成分和普通牛無差異，并比較了有代表性的 α-酪蛋白質(zhì)、β-酪蛋白質(zhì)、κ-酪蛋白質(zhì)等的含量，發(fā)現(xiàn)試驗組和對照組的主要蛋白百分含量沒有明顯差別，抗體凝集數(shù)值也在牛初乳正常值范圍內(nèi)。

但是，Chavatte-Palmer等[14]將25頭外表似乎健康的克隆牛和 19頭人工受精牛在同等條件下進行對比，盡管血液學(xué)指標在正常范圍內(nèi)，但血紅蛋白濃度和紅細胞壓積顯著低于普通牛，說明看似健康的克隆牛實際有貧血現(xiàn)象。還發(fā)現(xiàn) 21頭克隆牛和19頭普通牛中，雖然每日的采食量和日增重?zé)o顯著差異，但血纖蛋白原前者為 (3.27±0.21) g/L，后者為 (2.63±0.05) g/L (P＜0.01)，白蛋白前者為(29.9±2.4) g/L，后者為 (39.3±0.6) g/L(P＜0.001)，說明即使臨床上看似健康的克隆牛，在生理上存在著某種缺陷。而Kwong等對24頭體細胞克隆牛進行檢測，發(fā)現(xiàn)血液學(xué)、血清生化指標和淋巴細胞數(shù)量都在正常的范圍[15]。

Yang等采用體細胞計數(shù)這個辨別隱形乳房炎與否的參數(shù)，發(fā)現(xiàn)哺乳期克隆牛患該病的概率并不比普通牛大。同樣Walsh等將體細胞計數(shù)和pH值相結(jié)合檢測克隆牛乳汁，發(fā)現(xiàn)體細胞數(shù)和pH值都在健康奶牛的乳汁范圍內(nèi)[11]。

Heyman等將來自5個不同品系的37頭克隆奶牛與 38頭體外受精的普通牛在同樣的條件下進行了比較。通過3年時間共分析了150項共10 000多次測量來評估生理狀況。大多數(shù)數(shù)值在正常范圍內(nèi)，但是克隆牛外周血中嗜中性白細胞較多，并且血漿中 r-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶較低。乳汁和肉的構(gòu)成基本符合正常標準，但脂肪酸在組成上的差異說明克隆牛和普通牛在脂質(zhì)代謝上存在差異 (評價的標準是Delta-9脫氫酶活性高于普通牛)[1,8]。

克隆牛乳中脂肪含量，尤其是飽和脂肪酸的含量是消費者關(guān)注的焦點之一，因為它會導(dǎo)致心血管疾病。普通牛奶中，飽和脂肪酸約為62%，單不飽和脂肪酸約為30%，多不飽和脂肪酸約為4%，其他成分約為 4%[16-17]。但奶的構(gòu)成隨著動物品系、泌乳階段、年齡、飲食、干奶期長度、環(huán)境溫度、健康狀況及季節(jié)等變化而變化[18]，有的甚至由于不同的試驗條件而得出不同的結(jié)果，克隆牛乳的檢測也應(yīng)該考慮這些因素。

2.3 肉質(zhì)分析

Takahashi等分析了胚胎細胞克隆牛、體細胞克隆牛和普通牛的肉質(zhì)化學(xué)構(gòu)成、氨基酸以及脂肪酸等方面。同時對肉質(zhì)的消化性率、反應(yīng)原性以及致突變性進行了研究，皆未發(fā)現(xiàn)明顯的差異[19]。

Tian等依照工業(yè)標準分析了100多個反映肉質(zhì)量的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)90%以上的被檢參數(shù)無顯著差異。而只有12個指標不同，其中腸系膜脂肪總量、產(chǎn)量積分、胸最長肌占軀體重量比、腎葉脂肪次亞麻酸的量、胸最長肌次亞麻酸的含量、半腱肌中次亞麻酸的含量、半腱肌中油酸、軟脂酸、棕櫚酸、亞油酸的量在克隆牛肉中高于普通牛肉；而半腱肌中粗蛋白和水分含量在克隆牛肉中低于普通牛肉。為了確定用于分析的肉組織是否健康，所有器官在屠宰后進行了組織學(xué)分析，克隆動物的器官包括肝臟、腎臟、肺臟、脾臟、甲狀腺和腎上腺。除了膽結(jié)石，無其他任何異常[13]。實際上，由于飼養(yǎng)管理引起的膽結(jié)石在普通牛中也很常見[20]。Heyman等將37頭克隆奶牛與 38頭體外受精的普通牛在同樣的條件下進行肌肉重復(fù)活檢，發(fā)現(xiàn) 8月齡克隆牛肌肉氧化活性要高于對照組，發(fā)現(xiàn)克隆牛肌肉成熟較晚[1]。說明從肉質(zhì)的生化特點而言，克隆牛與普通牛之間還是存在一定的差異。

Takahashi等對克隆的日本黑牛肉首次進行了生物化學(xué)和生物學(xué)分析，未發(fā)現(xiàn)明顯差異[19]。由于樣本來自同一個體，因此，該結(jié)果無代表性。Juriea等分別對 9頭克隆牛和 8頭普通牛在 8、12、18、和24個月時對肌肉的各項指標進行分析，采用電泳法對肌凝蛋白重鏈 (MyHC) 進行分析，發(fā)現(xiàn)8和12個月的克隆牛肉中MyHC I和MyHC IIa顯著高于普通牛肉，而 MyHC IIb顯著低于普通牛肉。但是在12個月以后的克隆牛肉中未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。采用乳酸脫氫酶 (LDH) 檢測糖無氧酵解和采用異檸檬酸脫氫酶 (ICDH) 檢測有氧代謝，發(fā)現(xiàn)LDH活性在任何年齡組中無差異，而ICDH活性在8和12個月的克隆牛肉中顯著高于對照組[21]。因此，說明 8到 12個月的克隆牛肉伸縮性較低，可能與克隆動物肌肉分化較晚有關(guān)。Picard等也發(fā)現(xiàn)妊娠260 d的克隆牛胎兒肌肉伸縮性顯著低于普通牛對照組[22]。說明克隆牛和普通牛之間，至少在肉質(zhì)的分化和肌纖維等方面仍存在明顯差異。

2.4 內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測

以前的研究發(fā)現(xiàn)在體細胞重編程過程中，逆轉(zhuǎn)錄病毒基因序列隨著染色體重塑可能激活，這也是克隆動物食品風(fēng)險評估過程中的重要問題。Quivy等采用牛白血病病毒模型發(fā)現(xiàn)，該病毒表達后的蛋白可以改變細胞核結(jié)構(gòu)。因此，即使內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因序列在表觀遺傳學(xué)上是沉默的，但由于它存在基因組序列中，改變?nèi)旧w重塑的可能性是存在的[23]。此外，沉默的內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列在生理或病理情況下可以重新激活[24-25]。對同樣條件下的15頭克隆牛和15頭普通牛血液進行牛內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列分析，發(fā)現(xiàn)克隆牛和普通?；蚪M中都存在3個牛內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列[26]，并且發(fā)現(xiàn)克隆?；蚪M和普通牛中該病毒序列拷貝數(shù)也完全一樣，說明體細胞克隆牛同樣帶有牛內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因。同時在血液內(nèi)未檢測到RNA，說明核移植過程不會誘導(dǎo)該基因序列的改變，也不會激活該基因[27]。由于牛內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列可能產(chǎn)生其他的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒，還對外周血中單核細胞進行了體外補充試驗，結(jié)果在牛外周血單核細胞上清液和牛人細胞共培養(yǎng)物內(nèi)都未檢測到逆轉(zhuǎn)錄酶。Heyman等也對牛內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒是否會激活進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒沒有進行轉(zhuǎn)錄，在血液中也沒有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的 RNA[1]。由于牛內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒方面的資料較少，就目前的資料可以推斷來自克隆牛內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒序列的風(fēng)險并不高于普通牛。

2.5 動物試驗

在食品安全評估過程中，動物試驗是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為了評估克隆牛肉和奶的營養(yǎng)價值，采用小鼠做試驗，將來自相同泌乳階段的 3頭克隆奶牛和3頭普通奶牛乳汁制成奶酪冷凍保存。牛肉來自屠宰場的3歲克隆奶牛和普通奶牛。將小鼠分為4組(克隆牛奶類、普通牛奶酪、克隆牛肉和普通牛肉)，飼喂 3周后，對采食量、行為、體重等進行監(jiān)測，試驗組和對照組差異不顯著[28]。分析4組小鼠血漿內(nèi)免疫球蛋白發(fā)現(xiàn)，各組間變異原性無任何差異，抗體IgE、IgG、IgA和IgM水平在普通牛肉和牛乳組中與克隆牛肉和牛乳組中無差異，但都顯著高于空白組。Takahashi等將胚胎細胞克隆牛肉、體細胞克隆牛肉和普通牛肉粉飼喂小鼠14周，在增長、運動性能、神經(jīng)反射、性周期、尿檢、血液學(xué)、血液生化和組織學(xué)等方面均未發(fā)現(xiàn)明顯差異。因此，得出的結(jié)論是克隆牛和普通牛肉在生物學(xué)和生化化學(xué)上無顯著差異[19]。Heyman等采用小鼠試驗對克隆奶牛與體外受精的普通牛的肉和奶的營養(yǎng)進行評估，發(fā)現(xiàn)在采食量、增長率以及變應(yīng)原性上無顯著差異[1,8]。

盡管，動物試驗未發(fā)現(xiàn)克隆動物產(chǎn)品與普通動物存在明顯差異，由于變異反應(yīng)在人和動物中差異明顯，因此，以上試驗不能完全排除克隆牛肉和牛乳不會導(dǎo)致變異反應(yīng)的可能性，即不含致敏原。對于潛在的致敏原還需進一步試驗。

3 總結(jié)

迄今，還沒有理想的檢測體細胞克隆動物食品安全性的技術(shù)手段。以前，也只是對胚胎細胞克隆牛肉質(zhì)量進行研究[29]。因為胚胎克隆動物來自發(fā)育早期階段受精胚胎的卵裂球，卵裂球本身具有分化全能性，在發(fā)育過程中基本不需進行基因重編程，所獲得的克隆動物不存在風(fēng)險。這也是胚胎克隆動物被食用而安全性不被重視的主要原因[30]。就體細胞克隆動物產(chǎn)品試驗而言，大部分被檢測的數(shù)值和對照組沒有明顯不同，并且所有參數(shù)都符合人類食用標準。但需要指出的是，這些研究有的是針對一小部分樣本，有的僅檢測了部分指標而得出試驗結(jié)果，目前還不足以說明體細胞克隆動物的肉和奶對人體健康無影響。此外，嚴格地從生物學(xué)角度而言，由于克隆牛肌肉延遲成熟，并且肉和乳汁內(nèi)脂肪酸的構(gòu)成上存在差異，需要進一步分析由此帶來的結(jié)果，相關(guān)的檢測指標也應(yīng)該逐步增加，以便徹底排除克隆動物產(chǎn)品帶來的任何風(fēng)險。隨著體細胞克隆技術(shù)的進一步推廣和應(yīng)用，今后應(yīng)該從以下 3方面進行完善：1) 利用猴子、猩猩等靈長類動物對克隆食品進行遺傳毒性試驗，通過靈長類動物的傳代來評估克隆動物食品才能基本符合人類的食品安全要求；2) 體細胞克隆動物的肉、奶及其制品必須標上詳細的說明，包括供體細胞和受體卵母細胞基因型和來源、受孕母畜的品系、克隆代數(shù)及飼養(yǎng)、生長環(huán)境條件等；3) 建立一系列具有自主知識產(chǎn)權(quán)的體細胞克隆動物肉、奶及其相關(guān)產(chǎn)品評估技術(shù)平臺，為今后簡便、快速、高效地檢測克隆動物產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。盡管評估克隆牛產(chǎn)品仍有大量的后續(xù)工作要做，但目前，各個方面的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)了樂觀的趨勢，即對克隆牛的肉質(zhì)和奶質(zhì)的安全性基本上給予了肯定。有理由相信克隆牛產(chǎn)品能夠在不久的將來進入人類食物鏈。

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Product safety analysis of somatic cell cloned bovine

Song Hua, Jie Lan, Yongli Song, Chenglong Lu, and Yong Zhang

College of Veterinary Medicine,Northwest Agriculture & Forestry University,Yangling712100,China

Received:October 16, 2009;Accepted:March 15, 2010

Supported by:Major Projects of Cultivating New Varieties by Transgenic Technology (No. 2008ZX08011-004).

Corresponding author:Yong Zhang. Tel: +86-29-87080092; Fax: +86-29-87080085; E-mail: zhy1956@263.net

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項 (No. 2008ZX08011-004) 資助。