組織工程骺板軟骨治療骺板損傷的研究進(jìn)展

李文超 綜述 許瑞江 審校

解放軍總醫(yī)院 小兒外科，北京 100853

骺板是位于骨骺與干骺端之間的軟骨組織，負(fù)責(zé)長管狀骨的生長。骺板組織是長管狀骨中最薄弱部位，在各種因素作用下容易出現(xiàn)骺板損傷。然而骺板自身修復(fù)能力欠佳，損傷的骺板組織常被骨組織修復(fù)，即骨骺和干骺端之間形成骨性連接(骨橋)。根據(jù)骨橋的產(chǎn)生部位及面積可導(dǎo)致不同程度的肢體短縮和成角畸形。臨床上采用骨橋切除及各種材料填充的方法僅在治療小面積(<30%)的骺板損傷中取得了一定的臨床效果。隨著組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展，眾多研究逐漸致力于促進(jìn)骺板組織再生、防止骨橋形成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較滿意，現(xiàn)就其研究進(jìn)展綜述如下。

1 骺板組織結(jié)構(gòu)及骨橋形成

依據(jù)骺板細(xì)胞的組織形態(tài)和生物學(xué)功能將其在解剖上分為：靜止區(qū)、增殖區(qū)、肥大區(qū)和鈣化區(qū)等[1]。靜止區(qū)中含有大量前軟骨干細(xì)胞，通過增殖分化形成典型的柱狀結(jié)構(gòu)并分泌Ⅱ型膠原及蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)。之后在堿性磷酸酶、骨形態(tài)發(fā)生蛋白及甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白等多種因素共同作用下調(diào)節(jié)鈣鹽沉積，形成鈣鹽晶體向成骨方向分化，促進(jìn)肢體生長[2]。

骨橋組織的形成機(jī)制尚不清楚。早期研究認(rèn)為骨橋來源于靜止區(qū)干細(xì)胞損傷或骨骺與骺板間的紊亂。后期研究顯示在骨骺和干骺端之間的血流循環(huán)紊亂將引起骨橋組織形成。其中骨小梁表現(xiàn)為干骺端松質(zhì)骨的軟骨內(nèi)成骨的形態(tài)學(xué)和分子學(xué)的特征[3]。Lee等[4]報(bào)道骨橋來源于BMSCs向成骨細(xì)胞直接分化；未發(fā)現(xiàn)Ⅱ型膠原、血管內(nèi)皮生長因子及其他與軟骨成骨相關(guān)的分子學(xué)特征。Xian等[5]研究顯示前成骨干細(xì)胞在細(xì)胞因子作用下向成骨方向分化，此外，白介素和腫瘤壞死因子等炎癥細(xì)胞及轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、堿性成纖維生長因子(bFGF)和胰島素樣生長因子1(IGF-1)等細(xì)胞因子能降低軟骨形成轉(zhuǎn)化因子Sox-9mRNA表達(dá)以抑制軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[6]。

2 組織工程骺板軟骨修復(fù)骺板損傷

臨床上主要采用骨橋切除，填充脂肪、肌肉和肌腱等生物材料以及骨蠟、骨水泥及多聚體硅膠等非生物材料。上述材料僅具有機(jī)械支持作用，不具備生長能力，臨床效果欠佳。組織工程技術(shù)在治療骺板損傷方面取得了良好的實(shí)驗(yàn)效果，能夠促進(jìn)骺板軟骨再生，減輕患兒肢體的畸形程度。其中包括種子細(xì)胞、支架材料和細(xì)胞因子三個方面。

2.1 種子細(xì)胞 種子細(xì)胞包括骺板細(xì)胞、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞以間充質(zhì)干細(xì)胞等，根據(jù)來源情況分為自體細(xì)胞、同種異體細(xì)胞和異種細(xì)胞。

骺板細(xì)胞：骺板細(xì)胞具有良好的組織來源及細(xì)胞生物學(xué)功能，成為組織工程骺板的首選細(xì)胞，也是修復(fù)骺板損傷的重要保障。自體骺板細(xì)胞應(yīng)用廣泛，然而存在著來源不足及二次損傷等缺點(diǎn)；同種異體細(xì)胞來源充分，然而可能引起傳染性疾病或者免疫排斥反應(yīng)。Bently等[7]采用同種異體骺板細(xì)胞修復(fù)骺板損傷模型，骺板細(xì)胞形成類似骺板組織的柱狀結(jié)構(gòu)。但是，有研究將骺板細(xì)胞直接植入羊脛骨骺板損傷模型，出現(xiàn)明顯的骨橋組織并伴有炎癥反應(yīng)[8]。

關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞： 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的生物學(xué)功能與骺板細(xì)胞相似，分泌蛋白聚糖和Ⅱ型膠原等細(xì)胞外基質(zhì)。Tobita等[9]采用自體膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞復(fù)合膠原凝膠植入幼兔骺板損傷模型，組織學(xué)顯示細(xì)胞合成細(xì)胞外基質(zhì)，防止骺板早閉的發(fā)生。Lee等[10]將軟骨細(xì)胞復(fù)合瓊脂糖修復(fù)骺板損傷，影像學(xué)顯示肢體生長阻滯及成角畸形得到明顯糾正。然而，關(guān)節(jié)軟骨不具備骺板組織的多層柱狀結(jié)構(gòu)，長時間體外培養(yǎng)和傳代過程中難以維持細(xì)胞表型，容易出現(xiàn)細(xì)胞老化現(xiàn)象。

間充質(zhì)干細(xì)胞： 間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一系列具有多向分化潛能、自身再生的細(xì)胞，來源于骨髓、滑膜、骨骼肌和脂肪組織。MCSs形成集落成纖維細(xì)胞，還表達(dá)眾多細(xì)胞表面蛋白和標(biāo)記(CD44，CD71，CD90，CD105，CD120a，CD124以及CD166)。骨髓、骨膜和脂肪來源的MSCs植入幼兔骺板損傷模型中，影像學(xué)顯示脛骨的成角畸形得到明顯糾正[11]。Yoo等[12]將軟骨膜干細(xì)胞誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞復(fù)合纖維蛋白球植入幼兔脛骨骺板缺損模型，可見簇狀的類軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Chen等[13]將BMSCS復(fù)合瓊脂糖凝膠植入骺板損傷模型，組織學(xué)顯示MSCs具有軟骨分化潛能，形成柱狀結(jié)構(gòu)的類骺板組織，脛骨短縮及成角畸形得到明顯改善。

2.2 支架材料 支架材料是種子細(xì)胞的生存環(huán)境和代謝場所，其組織結(jié)構(gòu)和功能變化直接影響組織工程骺板的生物學(xué)功能。充填劑復(fù)合物或支架材料為種子細(xì)胞提供三維依附支架和力學(xué)環(huán)境，刺激MSCs的生長及向軟骨方向分化，使種子細(xì)胞均勻分布及促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖。此外，支架材料填充骺板缺損能夠延緩骨橋發(fā)生。

細(xì)胞基質(zhì)材料分為天然支架、人工合成支架及兩者的復(fù)合物，包括藻酸鹽、膠原、聚乙醇酸、聚乳酸、透明質(zhì)烷、聚殼糖、膠原-氨基葡萄糖聚合物、聚乳酸-透明質(zhì)烷聚合物、透明質(zhì)烷-殼聚糖復(fù)合水凝膠等。此外，可注射性或體內(nèi)原位交聯(lián)、聚合的材料也是良好的細(xì)胞攜帶材料及缺損填充支架，如瓊脂糖、膠原、殼聚糖、藻酸鈣和透明質(zhì)烷。瓊脂糖以良好的生物學(xué)功能在組織工程中得到廣泛應(yīng)用，瓊脂糖能夠促進(jìn)骺板細(xì)胞進(jìn)行整合修復(fù)、相互依附。瓊脂糖凝膠復(fù)合骺板細(xì)胞能夠修復(fù)骺板損傷模型，糾正肢體短縮及成角畸形[10]。

纖維蛋白凝膠源于血漿纖維蛋白原的交聯(lián)結(jié)合作用，模擬生理凝血過程。纖維蛋白凝膠價格便宜、可降解，能夠促進(jìn)細(xì)胞和基質(zhì)材料的同源性混合，且已獲得批準(zhǔn)在臨床上廣泛應(yīng)用。纖維蛋白原和凝血酶的結(jié)合比例決定了纖維蛋白凝膠的微環(huán)境以及植入的MSCs的擴(kuò)展速度、增殖及分化情況[14]。由于纖維蛋白的溶解作用，其穩(wěn)定性欠佳，常需要聯(lián)合應(yīng)用抑肽酶等纖維蛋白溶解抑制劑以增加體內(nèi)試驗(yàn)的穩(wěn)定性和效力。抑肽酶能夠通過促進(jìn)糖胺聚糖及Ⅱ型膠原的表達(dá)來提高BMSCs的軟骨誘導(dǎo)作用，而且纖維蛋白凝膠支持TGF-β1的軟骨誘導(dǎo)作用。

殼聚糖具有可降解性、良好的生物相容性以及促進(jìn)組織愈合等特點(diǎn)，為細(xì)胞提供三維培養(yǎng)環(huán)境，能夠維持骺板細(xì)胞表型、防止細(xì)胞老化、促進(jìn)細(xì)胞增殖及合成細(xì)胞外基質(zhì)。殼聚糖作為MSCs的支架材料有效地修復(fù)幼兔50%的骺板組織缺損，維持骺板組織開放[15]。透明質(zhì)烷是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分，能夠維持軟骨結(jié)構(gòu)及生物力學(xué)功能的完整性。透明質(zhì)烷能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、新陳代謝、生物合成以及凋亡，并且抑制破壞性的炎癥細(xì)胞及蛋白酶的表達(dá)[16]。種子細(xì)胞黏附在透明質(zhì)烷表面分泌細(xì)胞外基質(zhì)，植入體內(nèi)不產(chǎn)生任何炎癥反應(yīng)，且在4個月內(nèi)完全降解。

不同支架材料聯(lián)合應(yīng)用與單獨(dú)支架相比具有明顯的優(yōu)勢。例如：多糖藻酸鈣凝膠能夠提高TGF-β促進(jìn)MSCs軟骨誘導(dǎo)作用；透明質(zhì)烷和海藻酸鈣復(fù)合具有劑量依賴性提高軟骨方向的誘導(dǎo)作用[17]。醋化透明質(zhì)酸和蛋白凝膠復(fù)合支架促進(jìn)骺板細(xì)胞增殖、分化及分泌細(xì)胞外基質(zhì)。透明質(zhì)酸和明膠復(fù)合的水凝膠具有良好的生物相容性以及軟骨誘導(dǎo)作用，能夠模擬軟骨外基質(zhì)的天然環(huán)境?？勺⑸湫缘慕宦?lián)凝膠易于使用，能夠填充各種不同形狀的缺損部位[18]。

2.3 細(xì)胞因子 細(xì)胞因子包括TGF-βs、IGF、bFGF、VEGF及PDGF等，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化以及生物學(xué)行為方面起著關(guān)鍵性作用。而且細(xì)胞因子在促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞方向分化以及細(xì)胞生物治療方面同樣發(fā)揮著重要作用[19]。TGF-β能夠刺激MSCs向軟骨細(xì)胞分化，促進(jìn)Ⅱ型膠原和糖胺聚糖等軟骨基質(zhì)分子的表達(dá)；而且促進(jìn)MSCs合成蛋白聚糖、接合蛋白、纖維調(diào)節(jié)、低聚物基質(zhì)蛋白及核心蛋白多糖等軟骨細(xì)胞外基質(zhì)[20]。BMP-2在骺板周圍軟骨膜以及肥大區(qū)中高度表達(dá)，能夠誘導(dǎo)Ⅱ型膠原基因的表達(dá)；BMP-4在體外實(shí)驗(yàn)中能夠提高肌肉來源的干細(xì)胞向成骨分化的作用[21]。IGF促進(jìn)骺板細(xì)胞成熟及合成細(xì)胞外基質(zhì)，還具有抑制骺板細(xì)胞肥大，維持骺板細(xì)胞表型的作用[22]。此外，骺板細(xì)胞聯(lián)合IGF植入軟骨缺損區(qū)域能夠促進(jìn)修復(fù)組織形態(tài)學(xué)及生物機(jī)械方面的改善[23]。VEGF在肥大區(qū)細(xì)胞中高度表達(dá)，觸發(fā)了骺板細(xì)胞鈣鹽沉積以及促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和干骺端的血管侵入[24]。TGF-β和IGF-1聯(lián)合應(yīng)用能夠在植入或內(nèi)在MSCs中發(fā)揮有潛力的雙重促進(jìn)作用。高濃度的IGF-1能夠提高TGF-β1誘導(dǎo)滑膜纖維組織中MSCs的軟骨分化作用。

3 展望

組織工程骺板在治療骺板損傷方面取得了一定的實(shí)驗(yàn)效果，然而仍存在著諸多問題有待進(jìn)一步探索和研究，具體主要有以下幾個方面：1)缺乏統(tǒng)一的評價標(biāo)準(zhǔn)：在不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施過程中，對于骺板損傷的面積、部位及觀察時間缺少統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，對修復(fù)結(jié)果以及對照評定仍需進(jìn)一步完善。2)支架材料的選擇：支架材料是組織工程骺板技術(shù)成功的關(guān)鍵，良好的支架材料應(yīng)具有良好組織相容性、合適的孔隙率、可降解性、三維立體結(jié)構(gòu)、良好的材料-細(xì)胞界面、可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度。3)細(xì)胞因子的應(yīng)用：細(xì)胞因子在體內(nèi)的各種信號途徑發(fā)揮各種生物學(xué)作用，然而外源性的細(xì)胞因子價格昂貴限制了實(shí)驗(yàn)應(yīng)用。軟骨細(xì)胞內(nèi)源性細(xì)胞因子以及細(xì)胞因子緩釋作用或?qū)⒊蔀檠芯拷裹c(diǎn)。4)構(gòu)建良好的組織工程骺板：體外構(gòu)建具有正常結(jié)構(gòu)的組織工程骺板組織，同時維持骺板細(xì)胞的各種生理功能達(dá)到修復(fù)骺板損傷的目的將成為眾多學(xué)者的研究方向。

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