重組轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究進(jìn)展

謝俊，黃英

重組轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究進(jìn)展

謝俊，黃英

轉(zhuǎn)鐵蛋白家族存在于脊椎和無脊椎動物中。該家族蛋白是由血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳轉(zhuǎn)鐵蛋白、黑色素轉(zhuǎn)鐵蛋白、碳酸酐酶抑制因子等構(gòu)成[1]。血清轉(zhuǎn)鐵蛋白（serum transferrin）在人、羅猴、狗、貓、兔、荷蘭豬、小鼠、大鼠、奶牛、綿羊、山羊、馬、火雞、鴨、海龜和響尾蛇中均有存在，主要由肝細(xì)胞合成，分布在膽汁、羊水、腦脊液、淋巴液、初乳和乳汁中，但血漿中含量最高（2.5 g/L），占血漿總蛋白的 4%，從血漿蛋白質(zhì)的含量看，列第四位。由于轉(zhuǎn)鐵蛋白具有鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)，抗菌活性，免疫調(diào)節(jié)活性等多種生物功能，并且轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）在藥物中轉(zhuǎn)運(yùn)方面也有特殊功能，其在臨床上的應(yīng)用越來越多，因此，人轉(zhuǎn)鐵蛋白（human transferrin，hTF）的臨床應(yīng)用及重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究已成為近年來生物工程技術(shù)研究領(lǐng)域的一個新熱點(diǎn)。

1 人轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)和功能

1.1 人轉(zhuǎn)鐵蛋白的結(jié)構(gòu)

人轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的大小為 33.5 Kb，包含 17 個外顯子和 16 個內(nèi)含子，mRNA 長 2318 bp，基因定位于3q21-qter[2]。hTF 是一種非血紅素結(jié)合鐵的 β-球蛋白，由679 個氨基酸殘基構(gòu)成，分子量為 79 （kD），含有 19 個分子內(nèi)二硫鍵和三個分子外糖鏈（其中兩個聚糖通過與 413和 611 位 Asn 的酰胺基相連，另外一個聚糖與 42 位 Ser的 O 相連）[3]。hTF 分子形成 N 端（336 個氨基酸）和C 端（343 個氨基酸）2 個結(jié)構(gòu)域，這 2 個結(jié)構(gòu)域有 42%的同源性。每個結(jié)構(gòu)域含有一個三價鐵離子結(jié)合位點(diǎn)，可逆地結(jié)合和釋放鐵離子。

1.2 人轉(zhuǎn)鐵蛋白的生物學(xué)功能

血清轉(zhuǎn)鐵蛋白其主要生理功能是負(fù)責(zé)運(yùn)載由消化管吸收的鐵和由紅細(xì)胞降解釋放的鐵，并以 TF-Fe3+的復(fù)合物形式進(jìn)入骨髓中，供成熟紅細(xì)胞的生成或輸送到機(jī)體的其他需鐵部位[4]。TF 也具有抗菌的活性。機(jī)體內(nèi)自由鐵含量過高會促進(jìn)病原物的生長，轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合自由鐵可作為一種減少細(xì)菌病原體感染的手段[5]。TF 還可作為生長因子，幾乎所有細(xì)胞株在無血清培養(yǎng)時，都需要人血清 TF 和胰島素的存在，并且不同類型的細(xì)胞對 TF 結(jié)合物的反應(yīng)不同，結(jié)果會分化成不同的細(xì)胞[6]。自由鐵離子和其簡單的配合物能催化 ·OH 的形成而使細(xì)胞具有毒性，但 TF 因能與游離鐵形成穩(wěn)定的鐵—轉(zhuǎn)鐵蛋白配合物，故具有清除有害的游離鐵離子，抑制自由基所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性作用。TF 還具有免疫調(diào)節(jié)活性。阻斷 TF 介導(dǎo)的鐵攝取能有效抑制淋巴細(xì)胞增殖。并且 Yun 等[7]還證實(shí)：在各種誘導(dǎo)物如脂多糖、肽多糖、病毒作用下，家蠶的轉(zhuǎn)鐵蛋白 mRNA 表達(dá)量顯著增加，說明家蠶的免疫反應(yīng)與轉(zhuǎn)鐵蛋白有關(guān)。

2 人轉(zhuǎn)鐵蛋白在臨床上的治療應(yīng)用

2.1 疾病診斷

人體中鐵缺乏或者鐵超負(fù)荷都會產(chǎn)生疾病，如患者血漿中缺乏轉(zhuǎn)鐵蛋白，就會導(dǎo)致出現(xiàn)小細(xì)胞低色素性貧血和肝、脾、胰腺等臟器中大量鐵蓄積。因此，在臨床診斷中，檢測轉(zhuǎn)鐵蛋白受體和鐵蛋白是缺鐵性貧血和慢性疾病引起的貧血（ACD）的鑒別診斷的指標(biāo)之一；在慢性肝疾病及營養(yǎng)不良時轉(zhuǎn)鐵蛋白下降，轉(zhuǎn)鐵蛋白的檢測也可以作為營養(yǎng)狀態(tài)的一項(xiàng)指標(biāo)。另外，測定尿轉(zhuǎn)鐵蛋白排泄率的變化可以更早地反映 II 型糖尿病患者的早期腎損害，而血清轉(zhuǎn)鐵蛋白的降低也可用來診斷腎臟病變的嚴(yán)重程度。

2.2 疾病治療

由于轉(zhuǎn)鐵蛋白具有多種生物學(xué)功能，在一些臨床疾病的治療中應(yīng)用廣泛。當(dāng)機(jī)體缺乏轉(zhuǎn)鐵蛋白時，會出現(xiàn)貧血；鐵超負(fù)荷，生長滯后和高感染的危險，而通過注入脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（apo-Tf）可有效地治療缺乏轉(zhuǎn)鐵蛋白貧血癥[5]。在缺血性疾病搶救和治療過程中，醫(yī)學(xué)家們逐漸發(fā)現(xiàn)，缺血所引發(fā)的組織損傷是疾病致死的主要原因，但組織造成損傷的主要因素，不是缺血本身，而是恢復(fù)血液供應(yīng)后，由于過量的自由基攻擊重新獲得血液供應(yīng)的組織內(nèi)的這部分細(xì)胞所造成的；而自由鐵離子能催化氧自由基形成，提高氧自由基的濃度。脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白可與自由鐵離子結(jié)合，降低氧自由基的濃度，減少組織的氧化還原損傷。因此，在疾病搶救和治療過程中注入脫鐵蛋白對缺血性再灌注損傷有很好的促進(jìn)作用[7]。同樣在放射治療過程中轉(zhuǎn)鐵蛋白含量減少，自由鐵離子濃度增高，注入脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵離子也可以降低氧化損傷[8]。在患者骨髓移植或者化療治療血液腫瘤過程中，由于體內(nèi)高濃度的自由鐵離子，影響了正常血清對條件致病菌的抑制作用，很容易導(dǎo)致細(xì)菌感染而使患者死亡，而注入脫鐵蛋白可降低自由鐵離子濃度，則可恢復(fù)血清對病原菌的抗性[9]。

2.3 腫瘤治療

研究發(fā)現(xiàn)，在許多增生細(xì)胞表面，幼紅細(xì)胞以及很多的腫瘤細(xì)胞上都發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR），并在白血病患者的細(xì)胞，轉(zhuǎn)移率高的贅生細(xì)胞和許多腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了TfR 過表達(dá)的現(xiàn)象。因此 TfR 成為了很好的腫瘤靶向標(biāo)記[10-11]。謝偉玲等[12]將轉(zhuǎn)鐵蛋白與苯甲酸酰肼結(jié)合形成靶向藥物，通過甲基噻唑基四唑（MTT）法檢測其對乳腺癌細(xì)胞和正常乳腺細(xì)胞的殺傷效果。研究結(jié)果還顯示轉(zhuǎn)鐵蛋白與苯甲酸酰肼結(jié)合的藥物對乳腺癌細(xì)胞的殺傷效果是正常細(xì)胞的 286 倍。因此，科學(xué)家利用轉(zhuǎn)鐵蛋白作為載體直接運(yùn)輸小分子量的藥物和毒物蛋白，或者通過脂質(zhì)體把藥物連接在抗轉(zhuǎn)鐵蛋白的抗體上，使帶有藥物和毒物蛋白的轉(zhuǎn)鐵蛋白與腫瘤細(xì)胞上的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合，將藥物運(yùn)輸?shù)教囟ǖ哪[瘤部位，達(dá)到特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。然而，轉(zhuǎn)鐵蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體復(fù)合物代謝循環(huán)較快，每次循環(huán)大約 4 ～5 min，影響了藥物運(yùn)輸?shù)男省２⑶医Y(jié)合鐵離子的 TF 與TfR 結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，釋放鐵離子成為脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白（apo-TF）回到細(xì)胞表面。但如果 apo-TF 與 TfR 親和力低不能繼續(xù)參與代謝，而每個轉(zhuǎn)鐵蛋白分子限制在 4 ～5 min 的循環(huán)過程，這就給轉(zhuǎn)鐵蛋白與細(xì)胞毒物綴合物的運(yùn)輸帶來了困難。Yoon 等[13]用基因工程改造轉(zhuǎn)鐵蛋白的受體，增加轉(zhuǎn)鐵蛋白在細(xì)胞內(nèi)停留時間，降低鐵離子的釋放速率，來提高轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞毒物的效率，以增強(qiáng)殺傷腫瘤細(xì)胞的治療效果。所以，利用基因工程、免疫、組織化學(xué)等技術(shù)修飾轉(zhuǎn)鐵蛋白或者轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體，使其高效特異地攜帶藥物、細(xì)胞毒物、基因片段等，將為癌癥治療帶來新的曙光。

3 重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究

轉(zhuǎn)鐵蛋白參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，具有抗菌、殺菌、自我保護(hù)的抗病性能，是抑制細(xì)菌繁殖的重要因子；近年來還發(fā)現(xiàn) TF 是細(xì)胞生長和增殖所必需的生長因子，所以在無血清細(xì)胞培養(yǎng)液中 TF 是必需的成分以確保細(xì)胞的生長和增殖；并且轉(zhuǎn)鐵蛋白或者轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的藥物傳遞對糖尿病及腫瘤等疾病有很好的臨床效果；同時，轉(zhuǎn)鐵蛋白還具有防止貧血、促進(jìn)雙歧桿菌的生長、抑制腸道致病菌和病毒體內(nèi)自由基的生成、緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和抗衰老等生理功能，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域中。因此，轉(zhuǎn)鐵蛋白已經(jīng)成為國際上競相研發(fā)的生物制品。但目前 TF的獲取主要來自獻(xiàn)血者的血漿之中?？裳吹墓?yīng)困難，以及有感染肝炎病毒和艾滋病病毒等的危險，限制了通過血漿來大量獲得 TF 蛋白的可能。利用基因工程技術(shù)讓人轉(zhuǎn)鐵蛋白基因在宿主中高效表達(dá)，既能大量獲得重組轉(zhuǎn)鐵蛋白，又能克服從血清中獲取的 TF 攜帶有傳染性的致病菌的危險。由于人轉(zhuǎn)鐵蛋白的治療和保健功能，因而對轉(zhuǎn)鐵蛋白的研究在急劇升溫，它已經(jīng)成為新世紀(jì)生命科學(xué)發(fā)展的最大熱點(diǎn)。王峰和黃璐圓[14]以人胎肝 cDNA 為模板，利用 PCR 方法克隆人轉(zhuǎn)鐵蛋白基因；通過與基因組序列對比分析基因組結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)人轉(zhuǎn)鐵蛋白基因與猩猩、猴子、兔子和老鼠的轉(zhuǎn)鐵蛋白氨基酸相似率分別為 94%、91%、78%、73%。近些年來，重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)系統(tǒng)的研究主要有以下幾個方面：

3.1 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

de Smit 等[15]用僅在 28 ℃ 可表達(dá) hTF 質(zhì)粒的啟動子，替換了常規(guī)的 42 ℃ 下表達(dá)的溫敏型質(zhì)粒的啟動子，使得培養(yǎng)液的溫度不必升高到 42 ℃。雖然 42 ℃ 可以激活許多蛋白酶的活性但也可促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解。因此，在 28 ℃培養(yǎng)液中有利于提高蛋白質(zhì)的合成。同時將 28 ℃ 溫敏型的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入蛋白酶缺陷型的大腸桿菌株內(nèi)生產(chǎn) rhTF，這樣很好地避免了菌株自身對 rhTF 的降解作用。通過這兩種方法的改進(jìn)，使轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)量達(dá) 60 mg/L。但是由于細(xì)菌不含有粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及高爾基體，不能把 N 聚糖連到肽鏈上，所以該重組的人轉(zhuǎn)鐵蛋白不具有生物活性；盡管Hoefkens 等[16]通過分離、復(fù)性實(shí)驗(yàn)證實(shí)：復(fù)性后的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白與標(biāo)準(zhǔn)品具有一樣的組成，并且純度高，具備結(jié)合鐵離子的功能，但復(fù)性的產(chǎn)率只有 5%。因此，由于包涵體具有不易溶解以及表達(dá)無活性的 hTF 復(fù)性成有活性的 hTF產(chǎn)率低等缺點(diǎn)，不能應(yīng)用大腸桿菌大規(guī)模的表達(dá) hTF。

3.2 酵母表達(dá)系統(tǒng)

由于酵母表達(dá)系統(tǒng)培養(yǎng)條件普通，生長繁殖速度迅速，而且酵母表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白 N 端純化簡單，成本小，還可完全去除血清；因此，酵母可作為 hTF 很好的表達(dá)系統(tǒng)。Mason 等[17]構(gòu)建以甲醇氧化酶為啟動子的 hTF/2N cDNA載體，用甲醇酵母表達(dá)轉(zhuǎn)鐵蛋白的 N 端，在甲醇的誘導(dǎo)下，搖瓶的培養(yǎng)液中檢測到其表達(dá)量為 150 ～ 240 mg/L。雖然表達(dá)量比較理想，但僅表達(dá)有功能的人轉(zhuǎn)鐵蛋白的 N 末端，全長蛋白的表達(dá)并未成功，而且質(zhì)譜法檢測出 N 末端含有1 ～ 2 個人轉(zhuǎn)鐵蛋白中并不存在的己糖。Sargent 等[18]通過敲除兩個與 N 相連的糖基位點(diǎn)，從啤酒酵母中純化出全長的轉(zhuǎn)鐵蛋白，表達(dá)量達(dá)到 1.5 mg/ml，已達(dá)到了商業(yè)化生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)，但是這種純化所需的微孔及膜抗原非常昂貴。

3.3 細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

黑腹果蠅 S2 細(xì)胞的特點(diǎn)在于它能自發(fā)地把數(shù)百種轉(zhuǎn)染過的質(zhì)粒拷貝整合到自身基因組上。隨著整合基因數(shù)量的擴(kuò)增，穩(wěn)定整合多克隆質(zhì)粒的細(xì)胞其表達(dá)始終能保持較高的水平，卻不會殺死細(xì)胞。Lim 和 Cha[19]構(gòu)建以果蠅金屬硫蛋白為啟動子的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白質(zhì)粒，用不同濃度的誘導(dǎo)物—硫酸銅，在不同的 S2 細(xì)胞濃度下檢測重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達(dá)量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)物濃度越高，細(xì)胞濃度越大，表達(dá)量越高；在 S2 細(xì)胞培養(yǎng) 72 h 后到達(dá)對數(shù)生長期，誘導(dǎo)物硫酸銅濃度為 700 μmol/L 時，轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)量最高為62 μg/ml。Mason 等[20]利用倉鼠嬰腎細(xì)胞生產(chǎn)轉(zhuǎn)鐵蛋白的氨基端片段，培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)鐵蛋白的氨基端片段濃度由最初的10 ～ 15 μg/ml 提升到 55 ～ 120 μg/ml，但用免疫血清替代物吸附分離轉(zhuǎn)鐵蛋白的氨基端片段，從培養(yǎng)液中只回收了80% 的表達(dá)量。因此，盡管細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可表達(dá)有活性的重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白，但由于表達(dá)量低并且成本過高，限制了其商業(yè)化的應(yīng)用。

3.4 動植物表達(dá)系統(tǒng)

3.4.1 植物表達(dá)系統(tǒng) Zhang 等[21]用成熟的 hTF 蛋白的氨基酸序列逆翻譯為水稻基因偏好的密碼子的 DNA 序列（與野生型的 hTF 核苷酸序列相比 GC 含量由 50% 提高到 65%）。然后構(gòu)建含有種子存儲蛋白的啟動子序列（Gt1）、Gt1 信號肽、合成的 hTF，終止序列的線性的人重組轉(zhuǎn)鐵蛋白（rhTF）表達(dá)載體，采用電轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入水稻的愈傷組織，結(jié)果在轉(zhuǎn)基因水稻后代的種子中檢測到了 rhTF，表達(dá)量為種子干重的 1%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了 Farran 等[22]提議的植物中表達(dá)重組蛋白可以進(jìn)入商業(yè)化應(yīng)用的臨界線—種子干重的 0.01%。并且通過鹽緩沖液萃取及陰離子交換色譜純化，重組轉(zhuǎn)鐵蛋白的純度達(dá)到 95% 以上，不但結(jié)構(gòu)上和天然人轉(zhuǎn)鐵蛋白相似，在可逆結(jié)合鐵離子及促進(jìn)細(xì)胞的生長和分化的功能方面也基本相同。因此，現(xiàn)已有利用水稻表達(dá)重組轉(zhuǎn)鐵蛋白這種既安全且成本低的方法進(jìn)行產(chǎn)品開發(fā)。

3.4.2 動物乳腺生物反應(yīng)器研制 動物乳腺作為外分泌器官，由于乳汁不會進(jìn)入體內(nèi)循環(huán)，而是隨乳汁分泌而排出動物體外，故不會影響轉(zhuǎn)基因動物本身生理代謝反應(yīng)；動物乳腺組織還具備一整套對蛋白進(jìn)行修飾和加工，如糖基化、羧化、磷酸化以及分子組裝修飾加工的能力，具有穩(wěn)定的生物活性；而且從奶牛中提取產(chǎn)品，操作比較簡單，生產(chǎn)成本較低。因此，利用動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)醫(yī)用、保健蛋白受到了生物科學(xué)家、醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)界的高度重視。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究所自 20 世紀(jì) 90 年代初期就開展了乳腺生物反應(yīng)器研究工作，構(gòu)建了在乳腺中能高效、特異表達(dá)重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的載體，不僅獲得了整合并表達(dá)人轉(zhuǎn)鐵蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，之后應(yīng)用催乳素轉(zhuǎn)基因小鼠與人轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠交配，得到雙重雜合子的轉(zhuǎn)基因小鼠，結(jié)果TF 轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中人轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)水平明顯提高[23]。近年來，該研究所又建立了大動物（牛/羊）生物反應(yīng)器研制重組人轉(zhuǎn)鐵蛋白的技術(shù)平臺，并運(yùn)用體細(xì)胞核移植克隆技術(shù)，獲得了數(shù)頭轉(zhuǎn)有人轉(zhuǎn)鐵蛋白（TF）的轉(zhuǎn)基因克隆牛。圖 1 中顯示了轉(zhuǎn)基因動物研制的基本技術(shù)路線；表 1 中總結(jié)了 rhTF 在不同表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)情況。

圖 1 轉(zhuǎn)基因動物研制的基本技術(shù)路線

表 1 rhTF 在不同表達(dá)系統(tǒng)中的比較

4 展望

目前已經(jīng)利用大腸桿菌，酵母，動物細(xì)胞表達(dá)了人的重組轉(zhuǎn)鐵蛋白，但總體來說蛋白產(chǎn)量低，生物活性差，不具備商業(yè)應(yīng)用價值。而動植物表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的轉(zhuǎn)鐵蛋白具有很好的生物活性，并且成本低，易規(guī)?；?。因此，構(gòu)建轉(zhuǎn)鐵蛋白的載體，制備轉(zhuǎn)鐵蛋白的克隆大動物（牛、羊）獲得高表達(dá)量、有活性的轉(zhuǎn)鐵蛋白將是解決轉(zhuǎn)鐵蛋白來源困難的有效途徑。雖然現(xiàn)在存在轉(zhuǎn)基因動物外源基因隨機(jī)整合，表達(dá)不很穩(wěn)定；轉(zhuǎn)基因動物克隆效率低；生物產(chǎn)品純化回收效率不理想等問題，但我們相信，隨著轉(zhuǎn)染技術(shù)，定點(diǎn)整合技術(shù)，克隆技術(shù)及生物分離技術(shù)的進(jìn)步，這些問題將迎刃而解，這將對轉(zhuǎn)鐵蛋白及其他藥用蛋白的開發(fā)有重要意義。利用轉(zhuǎn)基因動物—乳腺生物反應(yīng)器來生產(chǎn)大量有活性的藥用蛋白，基因藥物將是基因工程技術(shù)發(fā)展的一個趨勢，具有廣闊的應(yīng)用及市場前景，也對醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)做出不可估量的貢獻(xiàn)。

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作者單位：200025 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院（謝?。?；200040 上海市兒童醫(yī)院上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所（黃英）

通訊作者：黃英，Email：hying23@163.com

收稿日期：2010-08-13

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.011