125I放射性粒子對荷人結(jié)腸癌裸鼠治療效應(yīng)的實驗研究

任利彬，周正，杜云峰，許建華，沈恩允，王仙斌，高旭

125I放射性粒子對荷人結(jié)腸癌裸鼠治療效應(yīng)的實驗研究

任利彬，周正，杜云峰，許建華，沈恩允，王仙斌，高旭

【摘要】

目的觀察125I 放射性粒子組織間植入對裸鼠皮下人結(jié)腸癌移植瘤的局部抑制作用。

方法雌性 Balb/c 裸鼠 20 只，以人 Colo205 型結(jié)腸癌細(xì)胞建立裸鼠皮下人結(jié)腸癌實體腫瘤模型，待腫瘤體積長至理想大小，隨機分成 2 組，對照組不予任何處理，治療組給予移植瘤以125I 放射性粒子組織間植入，每周測量 2 次腫瘤體積，治療 27 d 后，處死裸鼠，觀察移植瘤的相對腫瘤體積（RTV）、相對腫瘤增殖率（T/C）、ABC 免疫組化染色觀察腫瘤增殖率[Brdu 標(biāo)記指數(shù)（LI）]。

結(jié)果治療 27 d 后，裸鼠均存活。治療組（125I 粒子組）移植瘤的 RTV 為（251.59 ± 72.24），明顯小于對照組的RTV（1087.94 ± 510.72），相對腫瘤增殖率為 23.13%，明顯減少，治療組的 LI 為（15.00 ± 5.00），明顯小于對照組的 LI（38.75 ± 6.29）。

結(jié)論①人 Colo205 型結(jié)腸癌模型是放射性粒子植入治療大腸癌基礎(chǔ)研究的良好模型之一；②125I 放射性粒子對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖有明顯的局部抑制作用；③125I 放射性粒子在腫瘤體內(nèi)累積一定劑量才會逐漸顯現(xiàn)治療效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】結(jié)腸腫瘤； 碘放射性同位素； 大鼠，裸；疾病模型，動物

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術(shù), 2010, 5(6):434-437

125I 放射性粒子組織間植入近距離放療是近年發(fā)展起來的一種腫瘤內(nèi)放射的微創(chuàng)治療方法，因其可操作性強、療效明確、并發(fā)癥少，能明顯改善患者的生存質(zhì)量[1-4]。我們采用人 Colo205 結(jié)腸癌細(xì)胞建立裸鼠結(jié)腸癌模型，行125I 放射性粒子組織間植入近距離放射治療，觀察其對腫瘤生長的抑制作用，旨為臨床的治療提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和儀器

雌性 Balb/c 裸鼠 20 只（合格證：SCXK 京2009-0004），SPF 級，6 ～ 8 周，體重 18 ～ 20 g，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供，于 SPF 級動物實驗室飼養(yǎng)。

人 Colo205 型結(jié)腸癌細(xì)胞株，來自美國標(biāo)準(zhǔn)菌種收藏所（American type culture collection，ATCC），編號：CCL-222，由北京同為時代生物科技股份有限公司惠贈；125I 粒子：活度 29.6 MBq（0.8 mCi），北京智博高科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號 2BS0908-13-01；ABC 檢測試劑（PK-4002）購自中杉金橋生物科技有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)基：改良型 1640 medium，編號 nul0215，購自美國Hyclone 公司；胰酶：編號 533715，美國 Gibico 公司產(chǎn)品；細(xì)胞孵化箱 MCO-15AC 為日本 Sanyo公司產(chǎn)品；Olympus BX51 顯微鏡照相系統(tǒng)為日本Olympus 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 人 Colo205 型結(jié)腸癌細(xì)胞的培養(yǎng) 將凍存于液氮中的人 Colo205 型結(jié)腸癌細(xì)胞復(fù)蘇，常規(guī)培養(yǎng)于含 10% 小牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)液中，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，采取胰酶消化法培養(yǎng)至細(xì)胞個數(shù)約 8 × 107，經(jīng)檢測細(xì)胞活度96%，將細(xì)胞制成濃度為 5 × 106/200 μl 的單細(xì)胞懸液。

1.2.2 裸鼠皮下移植瘤模型建立 于生物安全柜內(nèi)，用 1 ml 注射器取 200 μl 的單細(xì)胞懸液，以碘伏溶液消毒裸鼠右腹部皮膚，將細(xì)胞懸液接種于Balb/c 裸鼠右腹部皮下。

1.2.3 移植瘤內(nèi)植入125I 粒子 裸鼠皮下接種癌細(xì)胞后約 7 d，皮下移植瘤大小約 0.8 cm，隨機分成兩組，對照組不予任何處理，治療組給予移植瘤以125I 粒子植入。棉簽蘸取少許碘伏溶液消毒腫瘤組織及周圍皮膚，在遠(yuǎn)心端離腫瘤組織 0.5 cm 處皮膚進針，皮下斜行穿入腫瘤組織內(nèi)，使穿刺針末端位于腫瘤組織的中心，退出針芯，以無菌鑷夾取125I 放射性粒子通過植入器末端，以針芯將125I 放射性粒子推至腫瘤中心，然后緩慢退出粒子植入器，退出過程防止粒子隨之退出，棉簽按壓穿刺點數(shù)秒，無活動性出血后，將裸鼠放回鼠籠。

1.2.4125I 粒子植入術(shù)后數(shù)據(jù)獲得 兩組裸鼠每隔3 ～ 4 d 用游標(biāo)卡尺測量腫瘤最長徑（a）及與之垂直的最寬徑（b），利用公式，腫瘤體積（TV）= a × b2/2 計算腫瘤體積，再換算為相對腫瘤體積（RTV）= Vt/V0（V0為開始給藥時測量的 TV，Vt為給藥后每次測量的 TV），相對腫瘤增殖率T/C（%）= RTV治療組/ RTV對照組× 100%。治療 27 d，處死裸鼠前 6 h 經(jīng)腹腔注入 5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）液，取裸鼠腫瘤甲醛固定，制作蠟塊、切片、ABC 免疫組化染色。在顯微鏡下隨機計數(shù)10 個高倍視野中細(xì)胞總數(shù)及 Brdu 陽性細(xì)胞數(shù)，Brdu 陽性細(xì)胞數(shù)與細(xì)胞總數(shù)的比值為 Brdu 標(biāo)記指數(shù)（LI），從而反映腫瘤的增殖率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 人 Colo205 型結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠皮下移植瘤模型建立

經(jīng)過 7 d 的細(xì)胞培養(yǎng)，所培養(yǎng)人 Colo205 型結(jié)腸癌細(xì)胞達到實驗所需細(xì)胞個數(shù)，約為 1 × 108/只，最后調(diào)定細(xì)胞濃度為 5 × 106/200 μl，經(jīng)檢測細(xì)胞活度為 96%。

表 1 裸鼠皮下移植瘤相對腫瘤體積（RTV）（%）Table 1 The relative tumor volume (RTV) of nudemice transplantated tumor (%)

人 Colo205 型結(jié)腸癌細(xì)胞皮下注射于 Balb/c裸鼠右腹部，生長約 7 d 后，可觀察到裸鼠皮下直徑約 0.8 cm 的腫瘤結(jié)節(jié)。裸鼠皮下致瘤率 100%。

2.2 裸鼠皮下腫瘤體積變化

實驗開始后，125I 粒子組移植瘤生長速度明顯較對照組緩慢并在實驗第 6 天后腫瘤體積處于平臺期，在實驗最后階段，相對腫瘤體積有下降趨勢，而對照組裸鼠皮下移植瘤相對腫瘤體積一直生長（表 1、圖 1）。經(jīng)計算所得，相對腫瘤增殖率 T/C（%）125I 放射性粒子組為 23.13%，治療有效。

圖 1 裸鼠皮下結(jié)腸癌相對腫瘤體積（RTV）（%）Figure 1 The relative tumor volume (RTV) of nudemice transplantated tumor (%)

2.3 兩組裸鼠經(jīng)免疫組化染色 Brdu 標(biāo)記指數(shù)（LI）

治療 27 d 后腫瘤的 Brdu 標(biāo)記指數(shù)（LI），經(jīng)t 檢驗，125I 粒子組與對照組比較有顯著性差異（P ＜ 0.05），125I 粒子組裸鼠皮下移植瘤的 LI 明顯比對照組的低，說明移植瘤增殖率低，見表 2。125I 粒子組裸鼠腫瘤組織經(jīng)免疫組化染色顯示褐色的增殖細(xì)胞比對照組明顯減少，說明增殖率較低，見圖 2。

表 2 裸鼠皮下移植瘤 Brdu 標(biāo)記指數(shù)（LI）Tabel 2 The Brdu-LI of nudemice transplantated tumor

圖 2 裸鼠腫瘤組織經(jīng)免疫組化染色結(jié)果 × 400（褐色深染細(xì)胞為 Brdu 標(biāo)記的細(xì)胞，反映細(xì)胞的活躍程度。A：對照組；B：125I 粒子組）Figure 2 The result of tumor organization by immunochemistry ABC method × 400. Brown cell are marked by Brdu, to reflect the activity of cell. A: Control group; B: Iodine-125 particle group.

3 討論

裸鼠是一類先天性胸腺缺陷的小鼠，T 細(xì)胞發(fā)育受阻，導(dǎo)致 T 細(xì)胞介導(dǎo)免疫缺陷，接種異體組織或細(xì)胞時，不發(fā)生排斥反應(yīng)，從而可以建立人結(jié)腸癌腫瘤模型。針對大腸癌的臨床研究報道較少，基礎(chǔ)性研究報道相對更少[5]。本研究選用人Colo205 型結(jié)腸癌細(xì)胞為研究對象，考慮到結(jié)腸癌細(xì)胞來源于人原發(fā)性結(jié)腸癌，同源性強，與臨床的結(jié)腸癌具有相似性，能從一定方面反映臨床大腸癌治療的療效，為中晚期大腸癌的綜合治療方法提供實驗依據(jù)。

到 20 世紀(jì) 80 年代末，125I 已成為國外近距離放射治療中最常應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)核素[6]，在我國研究時間相對較短，2001 年，125I 粒子通過我國藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)，正式進入臨床使用，是將125I 放射性元素密封于鈦合金內(nèi)，制作成粗細(xì)只有 0.08 cm、長不到 0.5 cm 的小短棒。微型粒子發(fā)散出持續(xù)低能量的 X 線（27.4 ～ 31.5 keV）和 γ 射線（35.5 keV），輻射半徑 1.7 cm，半衰期約為 60 d。放射性粒子植入腫瘤體內(nèi)后，其劑量分布并非按照距離平方反比衰減，而是在很短的距離發(fā)生陡降[7]，對腫瘤周圍的組織及臟器的放射性損傷較小。

放射線在 DNA 分子中造成的破壞是由于光子能量直接作用于DNA 鏈，或間接地通過與放射分解所產(chǎn)生的游離基團（包括羥基、水合電子 e、氫原子及過氧化氫等）相互作用所產(chǎn)生的多種糖和堿基的病變。DNA 堿基的破壞也很常見，它在產(chǎn)生突變中起重要作用，從而有效控制腫瘤細(xì)胞的再增殖、再修復(fù)，截斷腫瘤細(xì)胞擴散的途徑，從而使腫瘤的體積減小并逐漸治愈。Kim[8]研究認(rèn)為：在連續(xù)照射過程中，腫瘤細(xì)胞損傷效應(yīng)累積，進而抑制細(xì)胞繁殖。增殖期細(xì)胞被殺傷后，處于非增殖期和細(xì)胞周期 G0 期的細(xì)胞進入敏感的 G2/M 期，持續(xù)不間斷地照射，乏氧細(xì)胞再氧合，增加放射敏感性，如果細(xì)胞死亡超過了細(xì)胞新生，腫瘤體積就變小了。

本實驗研究結(jié)果提示125I 粒子在裸鼠皮下結(jié)腸癌的治療過程中，腫瘤生長速度較對照組緩慢，隨著治療時間的延長，經(jīng)繪制相對腫瘤體積生長曲線可以看出，對照組裸鼠皮下結(jié)腸癌相對腫瘤體積曲線逐漸遠(yuǎn)離125I 粒子組，125I 粒子組、對照組腫瘤經(jīng)治療后 27 d 相對腫瘤體積經(jīng)過統(tǒng)計分析，125I粒子組皮下結(jié)腸癌移植瘤的相對體積明顯比對照組要小，考慮125I 放射性粒子植入腫瘤體內(nèi)，發(fā)射出的 γ 射線直接作用于 DNA 雙鏈，使其直接斷裂或破壞堿基，從而有效地控制了腫瘤細(xì)胞的再增殖、再修復(fù)，截斷了腫瘤細(xì)胞擴增的途徑。同時本文結(jié)果顯示在125I 粒子植入后第 6 天治療組相對腫瘤體積（RTV）處于平臺期，于第 20 天左右時，治療組 RTV 有下降趨勢，提示125I 粒子在腫瘤內(nèi)的持續(xù)放射劑量累積到一定量值時才出現(xiàn)放射治療效應(yīng)，見圖 1。

Brdu在 DNA 合成期（S 期）競爭性結(jié)合到DNA 的雙鏈中，經(jīng)免疫組化染色檢測腫瘤細(xì)胞Brdu 標(biāo)記指數(shù)（LI），反映腫瘤的增殖率，本文結(jié)果顯示125I 粒子組裸鼠皮下結(jié)腸癌增殖率均較對照組為低，有顯著性差異，再次證明了125I 放射性粒子對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，考慮本實驗研究采用人大腸癌細(xì)胞，可以為臨床的大腸癌綜合治療提供一定的實驗依據(jù)。

本實驗研究結(jié)果提示：①人 Colo205 型結(jié)腸癌模型是放射性粒子植入治療大腸癌基礎(chǔ)研究的良好模型之一；②125I 放射性粒子對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖有明顯的局部抑制作用；③125I 放射性粒子在體內(nèi)累積一定劑量才會逐漸顯現(xiàn)治療效應(yīng)。

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ObjectiveTo observe the therapeutic effect and the therapeutic mechanism of Iodine-125 radioactive particle interstitial irradiation on the nudemice transplantation tumor of human Colorectal cancer cell.

MethodsTo establish colon cancer model with human Colo205 colon cancer cells. When the diameter of transplant tumor is about to 0.8 cm, totally 20 male nudemice will be divided into two groups randomly: control group, Iodine-125 radioactive particle group. Measure the tumor volume twice per week. After 27 days treatment, the nudemice will be put to death at 6 hours before the Brdu injected into abdominal. Calculating the relative tumor volume (RTV), relative tumor Proliferation rate (T/C). Take the tissue of tumor, they will be detected by immunohistochemistry ABC method.

Results After the treatment, all of the nudemice were alive. The RTV of the treatment group is 251.59 ± 72.24, the RTV of the control group is 1087.94 ± 510.72, the difference of the treatment group compared with the control group was significal (P ＜ 0.05), tumor volume reduced obviously and growth velocity was inhibited.

Conclusions ①Human colon cancer model is a succeful model for Iodine-125 radioactive particle interstitial irradiation on the experimental study of colorectal cancer; ②Iodine-125 radioactive particle is safe, effective, feasible measure to malignant tumors;③Iodine-125 radioactive particle will reacts the effect after getting adequated dose in humor body.

【Key words】Colonic neoplasms; Iodine radioisotopes; Rats, nude; Disease models, animal

Author Affiliations:Office of Quality Control, The Central Hospital of Handan City, Handan 056001, China (REN Li-bin); Department of General Surgery and Surgical Oncology, China Meitan General Hospital, Beijing 10028, China (ZHOU Zheng, DU Yun-feng, XU Jian-hua); Beijing Cotimesbiotechnology Co., Ltd., Beijing 100176, China (SHEN En-yun); Department of Graduate, North China Coal Medical University, Tangshan 063000, China (WANG Xian-bin, GAO Xu)

Correspoding Author:ZHOU Zheng, Email: zhzh0386_cn@sina.com www.cmbp.net.cn

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(6):434-437

作者單位：056001 邯鄲市中心醫(yī)院質(zhì)管辦（任利彬）；100028 北京，煤炭總醫(yī)院普外腫瘤科（周正、杜云峰、許建華）；100176 北京同為時代生物技術(shù)有限公司（沈恩允）；063000 唐山，華北煤炭醫(yī)學(xué)院研究生部（王仙斌、高旭）

通訊作者：周正，Email：zhzh0386_cn@sina.com

收稿日期：2010-06-01

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.007

An experimental study on nudemice transplantation tumor of human colorectal cancer cell with iodine-125 radioactive particles

REN Li-bin, ZHOU Zheng, DU Yun-feng, XU Jian-hua, SHEN En-yun, WANG Xian-bin, GAO Xu

【Abstract】