成脎和成腙反應(yīng)速率反應(yīng)產(chǎn)物的比較

索 慧,黃雪松

(暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系,廣東廣州 510632)

0 前言

還原糖類化合物與苯肼(或2,4-二硝基苯肼)反應(yīng),生成糖脎及糖腙是20世紀(jì)末Fischer發(fā)現(xiàn)的[1]。該反應(yīng)對(duì)糖類的分離及鑒別起了決定性的作用,是糖類重要的反應(yīng)之一[2]。無(wú)論是醛糖還是酮糖,成脎反應(yīng)都發(fā)生在 C1和 C2上,不再繼續(xù)反應(yīng)生成三苯腙、四苯腙……,成脎反應(yīng)時(shí)間只需幾分鐘,反應(yīng)速率快。而關(guān)于用 2,4-二硝基苯肼與葡萄糖和果糖作用的報(bào)道比較少見(jiàn),Lloyd等[3]用葡萄糖、果糖等糖與 2,4-二硝基苯肼作用合成了糖腙,并對(duì)其旋光度、分子式等都做了測(cè)定,測(cè)出分子式是 C12H16O9N4。但是目前尚未有文獻(xiàn)對(duì)苯肼與兩種糖反應(yīng)生成糖脎、2,4-二硝基苯肼與兩種糖生成糖腙的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)和反應(yīng)速率等方面的差異作出分析和解釋,本文對(duì)產(chǎn)生這兩方面差異的原因做了分析和討論。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

(1)儀器。4000Q 7RAR質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)。

(2)試劑?？扇苄缘矸?廣東臺(tái)山粵僑試劑塑料有限公司,分析純);葡萄糖(廣東光華化學(xué)廠有限公司,分析純);果糖(上海實(shí)驗(yàn)試劑有限公司,分析純);冰醋酸(廣州化學(xué)試劑廠,分析純);2,4-二硝基苯肼(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純);無(wú)水乙醇(天津市化學(xué)試劑一廠,分析純)。高效層析硅膠GF254板(浙江臺(tái)州市路喬四甲生化塑料廠)。

苯肼試劑[4]:溶解4 mL苯肼于4m L冰醋酸和36 mL水中。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟

(1)糖脎的生成[4]。取2支試管,標(biāo)明號(hào)碼,分別加入0.28 mol/L葡萄糖、0.28mol/L果糖溶液,再分別加入2 mL苯肼試劑,充分振蕩此溶液,并將試管置于水浴中加熱,用秒表記錄試管中形成糖脎晶體所需的時(shí)間,晶體析出后,取出試管,讓其自然冷卻,做薄板層析(TLC)和質(zhì)譜(MS)。

(2)糖腙的生成[3]。3.6 g葡萄糖和果糖分別溶于5m L去離子水中,3.96 g 2,4-二硝基苯肼溶于100m L無(wú)水乙醇中,二者混合回流12 h,然后真空濃縮至干,加入50mL乙酸乙酯以除去少量的紅色氧化物,最后用 80%95%的乙醇溶解,重結(jié)晶獲得 2,4-二硝基苯肼葡萄糖腙和 2,4-二硝基苯肼果糖腙,做TLC和MS。

(3)質(zhì)譜檢測(cè)方法。ESI離子源,正負(fù)離子模式,Q1掃描方式。

(4)薄板層析的操作。實(shí)驗(yàn)選用硅膠 GF254為薄板層析的吸附劑,用毛細(xì)管吸取樣品溶液,輕輕地點(diǎn)樣到層析板邊緣 1 cm處的起點(diǎn)線上,樣品為斑點(diǎn),薄板層析在充滿展開(kāi)劑的密閉的層析缸中進(jìn)行。糖脎的展開(kāi)劑是氯仿/甲醇(79∶1)的混合溶液,糖腙的展開(kāi)劑是氯仿/甲醇(33∶7)的混合溶液,待展開(kāi)劑前沿至距板頂 2 cm時(shí),取出,晾干,在紫外燈下觀察其展開(kāi)效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 苯肼葡萄糖脎、果糖脎和 2,4-二硝基苯肼葡萄糖腙、果糖腙的質(zhì)譜特征

從圖1a、圖1c可以看出:葡萄糖、果糖與苯肼的成脎反應(yīng)產(chǎn)物有359.4、359.3的正離子峰(M+1),基本相等,即與質(zhì)子結(jié)合而形成的M+H峰,且均有397.3的鉀離子加合物峰(M+39),即與鉀離子結(jié)合而形成的M+K峰;從圖1b、圖1d可以看出:兩種成脎反應(yīng)產(chǎn)物均形成了M-1負(fù)離子峰(357.5),即形成的 M-H峰。由此可以確定,葡萄糖、果糖成脎反應(yīng)產(chǎn)物的分子量均為 358(即 1分子糖與兩分子苯肼的縮合產(chǎn)物的分子量),其分子結(jié)構(gòu)與前人報(bào)道的苯肼與這兩種糖的 C1和 C2均發(fā)生了反應(yīng)、其反應(yīng)產(chǎn)物是相同的,結(jié)果是一致的。

圖1 苯肼葡萄糖脎、果糖脎質(zhì)譜特征

從圖2a、圖2c可以看出:葡萄糖、果糖與2,4-二硝基苯肼的成腙反應(yīng)產(chǎn)物有361.4、361.3的正離子峰(M+1),基本相等,即與質(zhì)子結(jié)合而形成的M+H峰,且均有383.4的鈉離子加合物峰(M+23),即與鈉離子結(jié)合而形成的M+Na峰;從圖2b、圖2d可以看出,兩種糖成腙反應(yīng)產(chǎn)物形成了M-1負(fù)離子峰(分別為359.4和359.5),基本相等。由圖2可以推斷,2,4-二硝基苯肼葡萄糖腙和2,4-二硝基苯肼果糖腙的分子量是相同的,即都是 360。

圖2 2,4-二硝基葡萄糖腙、果糖腙質(zhì)譜特征

2.2 葡萄糖、果糖成脎與成腙反應(yīng)產(chǎn)物的比較

從薄板層析(TLC)圖3a可以看出:樣品3、4最上面點(diǎn)的Rf值和樣品1(苯肼)的Rf值是相同的,都為0.60,說(shuō)明這個(gè)點(diǎn)是未反應(yīng)完全的反應(yīng)物苯肼;樣品3、4有一個(gè)點(diǎn)的 Rf值和樣品 2(乙酰苯肼)的Rf值是相同,Rf值都為 0.26,說(shuō)明這個(gè)點(diǎn)是乙酰苯肼,這是因?yàn)榕渲票诫略噭r(shí)加入了乙酸,即乙酸與苯肼的酸堿反應(yīng)產(chǎn)物,該產(chǎn)物不是成脎反應(yīng)的產(chǎn)物,但影響到所獲反應(yīng)產(chǎn)物的純度、分離與純化;樣品 3和樣品4相同的斑點(diǎn),即為通過(guò)硅膠柱層析后,進(jìn)行 MS測(cè)定所判斷的葡萄糖脎和果糖脎(見(jiàn)圖1和圖2),兩者的 Rf是相同的,都為 0.34,它們的分子結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)如圖4所示。由圖3還可以看出:葡萄糖與果糖成脎反應(yīng)產(chǎn)物樣品中除含有上述 3種物質(zhì)外,還含有其它的物質(zhì),比如含有一取代的物質(zhì)等,但這還需要進(jìn)一步的分離、純化后再進(jìn)行研究。

由圖4a可以看出:這兩種糖與苯肼的成脎反應(yīng)產(chǎn)物均發(fā)生在 C1和C2上,其原因是苯肼只與羰基碳反應(yīng)后的產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,而與 2個(gè)碳反應(yīng)能夠依靠分子內(nèi)的N—H…N氫鍵鉗合形成較穩(wěn)定的六元環(huán)狀結(jié)構(gòu);那么,為什么成脎反應(yīng)卻只停留在C1和 C2上,糖分子中的其他羥基不能進(jìn)一步氧化,不再繼續(xù)反應(yīng)生成三苯腙、四苯腙呢?周宏[5]認(rèn)為成脎反應(yīng)從 α-羥基腙經(jīng)酸催化后直至最終生成脎(取代產(chǎn)物),整個(gè)過(guò)程均可維持六元環(huán)狀中間體(氫鍵的作用),這種過(guò)渡態(tài)較穩(wěn)定,所以,形成的脎靠這種分子內(nèi)氫鍵的作用形成六元環(huán)狀結(jié)構(gòu),也使得反應(yīng)僅限于在頭兩個(gè)碳原子上,發(fā)生雙取代反應(yīng),不再繼續(xù)反應(yīng)生成三苯腙、四苯腙。

圖3 葡萄糖、果糖成脎產(chǎn)物和成腙產(chǎn)物的薄層層析圖譜

從薄板層析(TLC)圖3b看出:葡萄糖、果糖成腙反應(yīng)產(chǎn)物的Rf值都是0.36,兩種成腙反應(yīng)產(chǎn)物的 Rf值是相同的,但是并不能說(shuō)明兩種反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)是相同的,從二者的結(jié)構(gòu)式(如圖4b和圖4c)看出二者性質(zhì)是相似的,從而導(dǎo)致二者 Rf值的相等。兩種糖與 2,4-二硝基苯肼的成腙反應(yīng)產(chǎn)物雖然分子量是相同的即都是 360,薄層層析中的 Rf值也相等,但是這兩種產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)是不同的,葡萄糖成腙反應(yīng)產(chǎn)物是發(fā)生在 C1位的羰基上,果糖成腙反應(yīng)產(chǎn)物是發(fā)生在 C2位的羰基上,2,4-二硝基苯肼只與葡萄糖和果糖的羰基碳反應(yīng),生成物不是同一種物質(zhì)。2,4-二硝基苯肼葡萄糖腙、果糖腙的分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖4b和圖4c。

圖4 葡萄糖脎、果糖脎、2,4-二硝基葡萄糖腙和果糖腙的分子結(jié)構(gòu)式

2 ,4-二硝基苯肼與這兩種糖的羰基反應(yīng)成腙,發(fā)生單取代,糖的其它碳原子不再進(jìn)一步發(fā)生上述反應(yīng)。該成腙反應(yīng)之所以與上述成脎反應(yīng)有這樣的差別,其原因有兩個(gè):其一,硝基吸電子效應(yīng)的影響。硝基吸電子效應(yīng)影響羰基的活性。羰基的活性除與羰基碳原子上的正電荷量有關(guān),還與親核試劑即苯肼和 2,4-二硝基苯肼上氮原子上的負(fù)電荷量有關(guān)系。氨基由-NH2組成,其中氮的電負(fù)性比氫大得多,因此電子云被吸到氮上,氮帶負(fù)電荷,而氫則帶有正電荷。在 2,4-二硝基苯肼的 C2和 C4位有兩個(gè)硝基,硝基是吸電子基團(tuán),而氨基-NH2是供電子基團(tuán),這就降低了-NH2的氮的負(fù)電性,影響到果糖的 C1位和葡萄糖 C2位的活性,從而影響單雙取代。這是其主要原因;其二,空間效應(yīng)的影響。糖腙分子C4位上的硝基-NO2離亞氨基-NH比較遠(yuǎn),不易形成氫鍵,而C2位上的硝基-NO2離亞氨基-NH中的N原子最近,位置最有利,在亞氨基-NH中,半徑很小、無(wú)內(nèi)層電子的帶部分正電荷的氫原子,容易使附近的C2位上的硝基-NO2中帶部分負(fù)電荷的 N原子有可能充分靠近它,從而產(chǎn)生靜電吸引作用,即形成N-H…O氫鍵。糖腙就依靠分子內(nèi)的N-H…O氫鍵鉗合形成較穩(wěn)定的六元環(huán)狀結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5a和圖5b。造成本來(lái)可同水形成氫鍵的活潑氫數(shù)目減少。且環(huán)狀結(jié)構(gòu)的存在使腙溶解度降低,以晶體析出,如果腙進(jìn)一步與 2,4-二硝基苯肼發(fā)生反應(yīng),就需破壞此穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),故糖的其它碳原子不再進(jìn)一步發(fā)生上述反應(yīng),此外,苯環(huán)上兩個(gè)硝基、氨基-NH2以及與苯環(huán)的空間阻礙作用也不利于反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)行,這是其次要原因。

2.3 成腙與成脎反應(yīng)的速率及影響因素

圖5 2,4-二硝基葡萄糖腙、果糖腙環(huán)狀結(jié)構(gòu)

從表1看出苯肼與兩種糖反應(yīng),成脎時(shí)間只需要幾分鐘,反應(yīng)速率大。在同一羰基試劑的情況下,果糖比葡萄糖的反應(yīng)速率快,周宏認(rèn)為[5]真正原因是果糖的整個(gè)烯醇化活化能較葡萄糖低。從表1中也可以看出 2,4-二硝基苯肼與糖反應(yīng),成腙反應(yīng)物需48 h甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能結(jié)晶,比與苯肼的反應(yīng)速率(只需要幾分鐘)就慢了很多。其原因可能是2,4-二硝基苯肼(親核試劑)與苯環(huán)相連的硝基-NO2所產(chǎn)生的吸電子效應(yīng)和空間效應(yīng)對(duì)產(chǎn)物和反應(yīng)速率有影響。

表1 葡萄糖脎、果糖脎、2,4-二硝基葡萄糖腙和果糖腙的反應(yīng)速率

(1)硝基吸電子效應(yīng)的影響[6-8]。在羰基與親核試劑(苯肼和 2,4-二硝基苯肼)的加成反應(yīng)中,反應(yīng)的控速步驟是:親核試劑(通常為負(fù)離子)進(jìn)攻羰基上碳原子并與碳結(jié)合的步驟。硝基吸電子效應(yīng)不僅影響兩種糖的單雙取代,還影響親核加成的反應(yīng)速率(見(jiàn) 2.2硝基吸電子效應(yīng)的影響)。所以果糖、葡萄糖與2,4-二硝基苯肼成腙反應(yīng)速率比與苯肼的成脎反應(yīng)速率慢。

(2)空間效應(yīng)的影響。2,4-二硝基苯肼比苯肼多了 2個(gè)硝基,前者的體積比后者大,親核試劑體積越大,空間阻礙作用越大,會(huì)影響到羰基的活性以及相鄰碳的活性,成腙反應(yīng)速率也就越慢,所以葡萄糖、果糖與 2,4-二硝基苯肼的成腙時(shí)間比與苯肼的成脎時(shí)間短同時(shí)影響單雙取代。

3 結(jié)論

成脎反應(yīng)產(chǎn)物多,反應(yīng)速率快,葡萄糖、果糖成脎時(shí)間分別是5.3 min、2.4 min,葡萄糖和果糖的成脎反應(yīng)都發(fā)生在 C1和 C2位,為雙取代反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物兩種以上;成腙反應(yīng)速率慢、產(chǎn)物少,2,4-二硝基苯肼與葡萄糖、果糖溶液反應(yīng)成腙時(shí)間均在 24 h或更長(zhǎng),反應(yīng)分別發(fā)生 C1或 C2位上,為單取代反應(yīng),反應(yīng)產(chǎn)物僅一種。羰基試劑的空間效應(yīng)和電子效應(yīng)影響這兩種糖的單雙取代和反應(yīng)速率,影響產(chǎn)物的數(shù)量和種類。

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