豬繁殖與呼吸綜合病毒結(jié)構(gòu)蛋白2b研究進(jìn)展*

李 勇,夏志平,高英杰,馬德慧

(1.解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林長(zhǎng)春130062;2.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,吉林長(zhǎng)春130062;3.內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,內(nèi)蒙古通遼028042)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒,病毒粒子呈球形,直徑為55 nm～60 nm,屬于尼多病毒目(Nidovirales)動(dòng)脈炎病毒科(Ateriviridae)動(dòng)脈炎病毒屬(Arterivirus),同一家族的病毒還有馬動(dòng)脈炎病毒(Equine Arteritis virus,EAV)、鼠乳酸脫氫酶增高癥病毒(Lactate dehydrogenase-elevating virus,LDV)和猴出血熱病毒(Simian hemorrhagic fever virus,SHFV)。根據(jù)病毒基因組核苷酸序列的不同,可將PRRSV分為2個(gè)基因型,即北美洲型(VR 2332)和歐洲型(LV)。目前我國(guó)發(fā)現(xiàn)的基因型均與美洲基因型的親緣性接近。PRRSV全基因組長(zhǎng)約15 kb。整個(gè)基因組含有9個(gè)開放閱讀框架,分別為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7,其中ORF2～ORF7編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白,ORF1a和ORF1b編碼具有聚合酶和解旋酶活性的非結(jié)構(gòu)蛋白。Wu H F等[1]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)不屬于PRRSV任何已知開放閱讀框編碼的多肽,經(jīng)研究該蛋白與EAV E蛋白生物學(xué)功能很相似,并命名為2b蛋白。

1 2b蛋白的發(fā)現(xiàn)及命名

1999年,Snijder E J等[2]報(bào)道在EAV內(nèi)發(fā)現(xiàn)了E蛋白,一種新的結(jié)構(gòu)蛋白,是由ORF2雙順反子編碼,E蛋白的翻譯起始密碼子位于ORF2a起始密碼子下游的兩個(gè)核苷酸。與EAV E基因相似,對(duì)PRRSV進(jìn)行基因組分析,發(fā)現(xiàn)ORF2中存在小的內(nèi)部重疊閱讀框ORF2b,編碼一個(gè)分子質(zhì)量為10 ku的蛋白,為了不與大結(jié)構(gòu)蛋白GP5(E蛋白)混淆,將該蛋白命名為2b蛋白與之相區(qū)分。由于ORF2b的發(fā)現(xiàn),故將原來(lái)的ORF2命名為ORF2a。

2 分子生物學(xué)特征

mRNA2同時(shí)編碼ORF2a和ORF2b,則呈現(xiàn)為雙順反子(dicistronic)。ORF2b位于ORF2a內(nèi)部,起始密碼子位于ORF2a起始密碼子下游的第6個(gè)核苷酸處。美洲型毒株ORF2b基因全長(zhǎng)222 bp,編碼73個(gè)氨基酸;歐洲型毒株ORF2b全長(zhǎng)213 bp,編碼70個(gè)氨基酸。2b蛋白非糖基化并與包內(nèi)膜結(jié)合,包括一個(gè)C末端親水氨基酸簇,有趣的是尼多病毒目其他動(dòng)脈炎病毒,同樣能編碼小的疏水性囊膜,在病毒形態(tài)形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。北美洲型病毒2b蛋白具有保守的豆蔻?；虲K-Ⅱ磷酸化位點(diǎn),在49和54核苷酸處包含兩個(gè)半胱氨酸殘基,其對(duì)病毒增殖是非必需的。研究發(fā)現(xiàn)2b蛋白并不能以二硫鍵的方式形成同型二聚體[4]。通過(guò)對(duì)感染豬血清中抗體的檢測(cè),證實(shí)歐洲型2b蛋白與GP2-GP3-GP4異質(zhì)三聯(lián)體結(jié)合,一起被整合到病毒體內(nèi),并在異質(zhì)多聚體進(jìn)入病毒過(guò)程中扮演重要的角色[5]。通過(guò)與GenBank中序列比對(duì)分析,發(fā)現(xiàn)北美洲毒株擁有第二個(gè)潛在的起始密碼子,位于ORF2bAUG下游第9個(gè)核苷酸處,但它并不是一個(gè)翻譯起始點(diǎn),對(duì)2b蛋白的結(jié)構(gòu)形成沒有影響。在蛋白所有氨基酸中,發(fā)現(xiàn)第3、7、48、50、62處氨基酸較易發(fā)生突變,除第50和62位氨基酸突變影響2b蛋白結(jié)構(gòu)外,其他突變因發(fā)生的都是同義突變而不影響蛋白結(jié)構(gòu)的完整性。

3 生物學(xué)功能

2b蛋白作為新蛋白,其生物學(xué)功能需要不斷的深入和完善。目前認(rèn)為2b蛋白在病毒感染過(guò)程中起作用。交聯(lián)實(shí)驗(yàn)證明,2b蛋白能通過(guò)非共價(jià)鍵與其他蛋白結(jié)合形成同型寡聚體,包括二聚體、三聚體和四聚體。而2b與N蛋白的結(jié)合仍需要進(jìn)一步證實(shí)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證2b蛋白的生物學(xué)功能,用基因敲除的方法去除ORF2b的起始基因,2b蛋白不能表達(dá),而PRRSV喪失感染細(xì)胞的能力GP2b-GP3-GP4三聚體不能進(jìn)入病毒體內(nèi),缺少了任何一種小結(jié)構(gòu)蛋白將減少2b蛋白聚合體進(jìn)入病毒體的數(shù)量[6-7]。將沒有了感染性的病毒進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),發(fā)現(xiàn)病毒仍然能通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,并在胞內(nèi)形成包涵體,使基因組不能釋放,復(fù)制過(guò)程受阻[8]。此時(shí)胞內(nèi)酸性環(huán)境使病毒膜蛋白發(fā)生構(gòu)象變化,暴露出隱藏的促膜融合蛋白結(jié)合區(qū)域,使病毒囊膜和內(nèi)涵體膜發(fā)生了融合(哪種細(xì)胞器引發(fā)了胞內(nèi)酸性環(huán)境還不清楚),接著發(fā)生脫殼過(guò)程。脫殼是病毒感染的關(guān)鍵步驟,此步驟發(fā)生在衣殼破解,釋放基因組進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)并開始復(fù)制的過(guò)程中。有趣的是,不是PRRSV與細(xì)胞膜直接融合,也沒有關(guān)于動(dòng)脈炎病毒屬具有促膜融合蛋白特性的報(bào)告。推測(cè)PPRSV可能有跨膜蛋白促進(jìn)病毒感染早期內(nèi)涵體的脫殼過(guò)程。應(yīng)用一種抗流感病毒的藥物金剛烷胺來(lái)驗(yàn)證其對(duì)PRRSV的阻斷效果,電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)PRRSV不能進(jìn)行復(fù)制,表明PRRSV的確擁能夠編碼具有離子通道活性的蛋白,其活性是在感染時(shí)進(jìn)行脫殼所必需的[9]。研究證明,2b蛋白能促進(jìn)病毒粒子脫殼,而在粒子組裝和釋放中并沒有發(fā)揮很大的作用。

2b蛋白主要集中在細(xì)胞核區(qū),包圍在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體,與核膜相連。動(dòng)脈炎病毒屬病毒2b蛋白能夠改變膜通透性,形成一種類似人工膜一樣的通道,具有陽(yáng)離子選擇透過(guò)性。Lee C等[10]研究數(shù)據(jù)表明,PRRSV 2b蛋白能改變菌膜通透性,抑制細(xì)菌的生長(zhǎng),并能增加潮霉素B進(jìn)入細(xì)胞的幾率。然而用病毒感染或者2b基因轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞,卻不能得到相同的結(jié)果,可能是由于2b基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的定位不同。在PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞內(nèi),2b蛋白出現(xiàn)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上,有可能參與子代病毒的加工過(guò)程,而不是移動(dòng)到細(xì)胞膜上。細(xì)菌體內(nèi)沒有細(xì)胞器,表達(dá)的2b蛋白則聚集在細(xì)菌內(nèi)膜上,導(dǎo)致膜變性,因此增加了膜的透過(guò)性。2b蛋白沒有改變哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜通透性,說(shuō)明病毒進(jìn)入細(xì)胞時(shí)膜結(jié)構(gòu)破壞和細(xì)胞溶解不是2b蛋白的作用[11]。目前的研究證實(shí),PRRSV 2b蛋白具有潛在的形成病毒孔的活性,有使病毒脫殼的離子通道的功能。然而,由2b蛋白介導(dǎo)的病毒感染細(xì)胞的離子通道類型(如Na+、K+、Ca2+、Cl—、H+等)還沒有被確定。

4 免疫學(xué)特性

豬感染PRRSV后,體內(nèi)能產(chǎn)生一系列的抗該病毒的特異性抗體,但體液免疫在免疫保護(hù)作用中的機(jī)制尚不完全清楚。在感染后的5 d～7 d出現(xiàn)抗PRRSV的IgM,隨后的1周～2周消失;7 d～10 d后檢測(cè)到抗PRRSV的IgG,之后1周～3周達(dá)到頂峰,并持續(xù)數(shù)月;抗PRRSV的IgA在感染后14 d首次檢測(cè)到,24 d后達(dá)到最大值,38 d后消失[12]。2b蛋白特異性抗體首次出現(xiàn)在感染后第18、39天后達(dá)峰值,具有抗2b活性和免疫中和活性。當(dāng)感染后25 d,幾乎所有感染的豬都能檢測(cè)到中和抗體,但滴度很小,中和抗體低是PRRSV感染的典型特點(diǎn)[13]。2b蛋白能促進(jìn)IFN-γ的表達(dá),可抑制在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制,影響病毒蛋白的正常合成,還能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生超氧陰離子的能力。用病毒接種細(xì)胞發(fā)現(xiàn)接種后大約6 h出現(xiàn)GP5,M,N蛋白,而2b蛋白在接種后15 h才大量出現(xiàn),綠色熒光跟蹤標(biāo)記2b和GP2融合蛋白,結(jié)果顯示兩種蛋白都能表達(dá),然而2b優(yōu)先表達(dá),是ORF2表達(dá)的主要產(chǎn)物[14]。

5 結(jié)語(yǔ)

2b蛋白不是病毒裝配所必需的,但能促使PRRSV粒子脫殼,釋放RNA到宿主細(xì)胞內(nèi),具有影響病毒復(fù)制的作用,因此對(duì)其功能的研究非常重要。作為一種離子通道蛋白,2b蛋白的功能和結(jié)構(gòu)特征與A型流感病毒M2蛋白很相似,M2蛋白與病毒囊膜形成同型四聚體,具有典型的離子通道活性。通過(guò)M2通道移動(dòng)使病毒體內(nèi)形成酸性環(huán)境。結(jié)果M1蛋白從核蛋白復(fù)合體上分離下來(lái),促進(jìn)核蛋白復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核,流感病毒在此進(jìn)行復(fù)制[15]。病毒離子通道的研究是病毒病治療性藥物篩選的主要方法和手段,為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn),目前主要集中在流感病毒、丙型肝炎病毒、SARS病毒等的研究上[16-17]。

PRRS目前沒有特效治療藥物,人們更重視其免疫機(jī)理及疫苗研究,防止病毒侵入機(jī)體,以及抑制病毒在體內(nèi)的復(fù)制成為防控該病的主要方向。2007年,我國(guó)南方地區(qū)發(fā)生的高致病性藍(lán)耳病,最初被認(rèn)為是由非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp2缺失了30個(gè)氨基酸使病毒毒力增強(qiáng)所致,試驗(yàn)證明事實(shí)并非如此[18]。我們假想2b蛋白的突變或其高級(jí)結(jié)構(gòu)的變化使宿主細(xì)胞的膜通透性增強(qiáng)導(dǎo)致PRRSV的感染力增強(qiáng),因此通過(guò)對(duì)該蛋白的研究,篩選出特效阻斷性藥物,以應(yīng)對(duì)PRRSV抗原漂移和變異帶來(lái)的后果,彌補(bǔ)當(dāng)前PRRSV疫苗保護(hù)不力的現(xiàn)狀。

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