氧及活性氧代謝相關(guān)基因在大鼠肝臟再生中的作用*

藺 芳,張家洋,皮川真,徐存拴

(1.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)系,河南新鄉(xiāng)453000;2.華蘭生物工程股份有限公司,河南新鄉(xiāng)453000;3.河南省-科技部共建細(xì)胞分化調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南新鄉(xiāng)453000)

氧為機(jī)體代謝所必需。氧的一些代謝產(chǎn)物,如活性氧(reactive oxygen species,ROS)有重要生理作用[1]。氧及活性氧代謝包括氧化反應(yīng)、谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)、過氧化氫代謝及超氧化物代謝等[2]。正常情況下,細(xì)胞有清除活性氧、維持細(xì)胞氧化還原內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定功能,但是,當(dāng)活性氧產(chǎn)生過多或細(xì)胞保持氧化還原穩(wěn)定機(jī)制發(fā)生紊亂時(shí),會(huì)造成活性氧在體內(nèi)積累,并損傷核酸、蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子,導(dǎo)致機(jī)體衰老和疾病,如腫瘤、心腦血管病等。研究表明,肝臟有很強(qiáng)再生能力[3-4]。部分肝切除(partial hepatectomy,PH)[5]后,殘留的肝細(xì)胞增生以補(bǔ)償丟失的肝細(xì)胞,并且可精確感知再生肝的大小,適時(shí)停止再生[6-7],這個(gè)過程稱為肝再生(liver regeneration,LR)。肝再生包括肝細(xì)胞數(shù)量增多和肝臟體積增大。涉及細(xì)胞激活、去分化、增殖及其調(diào)控、再分化、組織結(jié)構(gòu)和功能重建等生理生化過程[8],受到包括氧及活性氧在內(nèi)的多種因素調(diào)控。通常根據(jù)細(xì)胞生理活動(dòng)將肝再生分為啟動(dòng)(PH后0.5 h～4 h)、G0/G1過渡(PH后4 h～6 h)、細(xì)胞增殖(PH后6 h～66 h)、細(xì)胞分化和組織結(jié)構(gòu)功能重建(PH后72 h～168 h)等四個(gè)階段。根據(jù)時(shí)間進(jìn)程分為早期(PH后0.5 h～4 h)、前期(PH后6 h～12 h)、中期(PH后16 h～66 h)、后期(PH后72 h～168 h)等四個(gè)時(shí)期。為在基因轉(zhuǎn)錄水平[9]了解氧及活性氧代謝相關(guān)基因在大鼠肝再生中作用,用含184個(gè)上述代謝相關(guān)基因的Rat Genome 230 2.0芯片[10]檢測(cè)了大鼠2/3肝切除后再生肝基因表達(dá)情況。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析了其在肝再生中的表達(dá)動(dòng)態(tài)、與肝再生的相關(guān)性和作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)用SD純系大鼠由河南師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,體重200 g～250 g。

1.1.2 主要試劑與儀器 GeneChip全自動(dòng)洗滌工作站450和高分辨芯片掃描儀3000為美國(guó)Affymetrix公司產(chǎn)品;Trizol試劑盒為Invitrogen公司產(chǎn)品;RNeasy mini試劑盒為QIAGEN公司產(chǎn)品;其他試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 將264只大鼠隨機(jī)分組,每組6只。按Higgins G M等[5]方法切除大鼠肝左葉和中葉,之后殘留肝細(xì)胞通過細(xì)胞增殖由基本不生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榭焖偕L(zhǎng)狀態(tài),以補(bǔ)償丟失、損傷的肝組織和恢復(fù)肝臟的生理功能,這些在切除剩余肝葉上重新生長(zhǎng)出的部分肝組織即為再生肝。并于0.5、1、2、4、6、8、12、16、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72、96、120、144、168 h的相應(yīng)恢復(fù)時(shí)間頸椎脫臼處死動(dòng)物,切取再生肝,置4℃PBS中涮洗3次,從右葉再生肝中部取100 mg～200 mg組織,將每組的來(lái)源于6只大鼠的樣品混合,總肝量為(0.1～0.2)g×6=0.6 g～1.2 g,于—80℃保存?zhèn)溆?。?duì)照組材料為正常成年大鼠肝。假手術(shù)(sham-operation,SO)組除不切除肝葉外,其他同部分肝切除組。試驗(yàn)中嚴(yán)格遵循中國(guó)動(dòng)物保護(hù)法。

1.2.2 總RNA提取與純化 總RNA提取按Invitrogen公司的Trizol試劑盒操作程序進(jìn)行[11]?？俁NA純化按QIAGEN公司的RNeasy mini試劑盒操作程序進(jìn)行[12]。用瓊脂糖凝膠電泳(180 V,0.5 h)檢測(cè)總RNA的28 S和18 S比例;其亮度約為2∶1;在260/280 nm波長(zhǎng)下測(cè)定總RNA濃度和純度[13]。

1.2.3 cDNA、cRNA的合成和純化 cDNA、cRNA合成按Affymetrix公司方法進(jìn)行。合成cDNA時(shí),模板量為1 μ g～8 μ g總RNA。合成生物素標(biāo)記的cRNA時(shí),取12 μ L上述cDNA溶液作模板。cDNA、cRNA純化按基因芯片分析樣品純化操作程序進(jìn)行。兩者的濃度、純度和質(zhì)量檢測(cè)方法同上。

1.2.4 cRNA片斷化和芯片檢測(cè) 取15 μ L濃度為1 μ g/μ L的cRNA,加6 μ L 5×片斷化緩沖液、9 μ L無(wú)RNA酶水混勻,94℃溫浴35 min,得到長(zhǎng)度為35 bp～200 bp的cRNA片斷。按Affymetrix公司提供的配方配制雜交液,然后將雜交液加至經(jīng)預(yù)雜交處理的Rat Genome 230 2.0芯片中,于45℃、60 r/min雜交16 h,吸去雜交液,用GeneChip全自動(dòng)洗滌工作站450(Affymetrix公司,USA)洗滌和染色芯片。用高分辨芯片掃描儀3000(Affymetrix公司,USA)掃描芯片,獲得基因表達(dá)信號(hào)值。

1.2.5 芯片檢測(cè)參數(shù)的獲取 用GCOS1.2軟件讀取、處理信號(hào)值數(shù)據(jù)。獲得歸一化后的信號(hào)值、信號(hào)檢出(P,A,M)以及試驗(yàn)和對(duì)照組的比值。

1.2.6 芯片檢測(cè)參數(shù)的校正 為減少芯片分析誤差,用Rat Genome 230 2.0芯片對(duì)每個(gè)時(shí)點(diǎn)再生肝重復(fù)檢測(cè)3次。將3次檢測(cè)的平均值視為矯正值,然后用Gene Math,Gene Spring(Silicon Genetics,San Carlos,CA),Microsoft Excel(Microsoft,Redmond,WA)等分析軟件對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和聚類分析[14-15]。

1.2.7 肝再生相關(guān)基因的確認(rèn) 根據(jù)GENEONTOLOGY(www.geneontology.org)網(wǎng)站的生物活動(dòng)分類,將具體的氧及活性氧代謝一詞輸入NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)和RGD(rgd.mcw.edu)等網(wǎng)站查找大鼠、小鼠和人的相關(guān)基因,并根據(jù)GENMAPP(www.genmapp.org)、KEGG(www.genome.jp/kegg/pathway.html)和BIOCARTA(www.biocarta.com/genes/index.asp)等網(wǎng)站的氧及活性氧代謝途徑圖匯總上述活動(dòng)相關(guān)基因。然后查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料對(duì)上述基因進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。除大鼠基因外,將現(xiàn)在認(rèn)為存在于人/小鼠、在大鼠肝再生中發(fā)生有意義表達(dá)變化的基因視為大鼠同源基因。最后把3次檢驗(yàn)結(jié)果相同或相似、至少在部分肝切除后一個(gè)表達(dá)上調(diào)或下調(diào)兩倍以上、部分肝切除組與假手術(shù)組差異顯著(0.01＜P＜0.05)或極顯著(P＜0.01)的大鼠基因和大鼠同源基因視為肝再生相關(guān)基因。

2 結(jié)果

2.1 氧及活性氧代謝相關(guān)基因在大鼠肝再生中表達(dá)變化

查NCBI、GENMAPP、KEGG、BIOCARTA、RGD等網(wǎng)站資料表明,178個(gè)基因參與氧及活性氧代謝。查Rat Genome 230 2.0芯片資料表明,該芯片含上述的150個(gè)基因。其中81個(gè)基因至少在部分肝切除后一個(gè)時(shí)點(diǎn)發(fā)生了有意義的表達(dá)變化,并且部分肝切除組與假手術(shù)組有顯著或極顯著差異、三次Rat Genome 230 2.0芯片檢測(cè)結(jié)果具有可重復(fù)性。因此,初步確認(rèn)這些基因與肝再生相關(guān)。其中,33個(gè)基因表達(dá)上調(diào),20個(gè)基因表達(dá)下調(diào),28個(gè)基因在有的時(shí)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)、有的時(shí)點(diǎn)表達(dá)下調(diào)(簡(jiǎn)稱上/下調(diào)表達(dá))。它們的上調(diào)范圍為對(duì)照的2倍～60倍,下調(diào)范圍為對(duì)照的2倍～10倍(表1)。

表1 81個(gè)氧及活性氧代謝相關(guān)基因在大鼠肝再生中表達(dá)豐度Table 1 Ex pression abundance of 81 oxygen and reactive oxygen species metabolism-associated genes during rat liver regeneration

(續(xù)表)

(續(xù)表)

2.2 氧及活性氧代謝相關(guān)基因在大鼠肝再生中起始表達(dá)及總表達(dá)情況

分析表明,肝再生各時(shí)點(diǎn)起始上調(diào)和下調(diào)及總表達(dá)的基因數(shù)為:0.5 h時(shí)均為13和4;1 h時(shí)12和4,23和6;2 h時(shí)4和2,18和4;4 h時(shí)1和2,17和4;6 h時(shí)3和3,21和7;8 h時(shí)0和1,18和8;12 h時(shí)0和4,11和11;16 h時(shí)3和5,13和9;18 h時(shí)3和4,18和11;24 h時(shí)1和1,15和10;30 h時(shí)3和1,11和11;36 h時(shí)0和1,9和6;42 h時(shí)0和1,12和5;48 h時(shí)0和0,17和9;54 h時(shí)0和0,14和8;60 h時(shí)1和0,13和8;66 h時(shí)2和0,16和7;72 h時(shí)0和0,12和6;96 h時(shí)0和0,12和6;120 h時(shí)0和1,18和9;144 h時(shí)0和0,9和5;168 h時(shí)0和0,7和7(圖1)。肝再生中基因起始表達(dá)的總體情況是:46個(gè)基因起始表達(dá)上調(diào),35個(gè)基因起始表達(dá)下調(diào)。其中,在肝再生啟動(dòng)階段(PH后0.5～4 h)30個(gè)基因起始上調(diào),12個(gè)基因起始下調(diào);G0/G1過渡階段(PH后4～6 h)4個(gè)基因起始上調(diào),5個(gè)基因起始下調(diào);細(xì)胞增殖階段(PH后6 h～66 h)16個(gè)基因起始上調(diào),21個(gè)基因起始下調(diào);細(xì)胞分化和組織結(jié)構(gòu)功能重建階段(PH后72 h～168 h)0個(gè)基因起始上調(diào),1個(gè)基因起始下調(diào)。肝再生中基因表達(dá)的總趨勢(shì)是:共表達(dá)上調(diào)317次,下調(diào)161次。其中,肝再生啟動(dòng)階段(PH后0.5 h～4 h)上調(diào)71次、下調(diào)18次;G0/G1過渡階段(PH后4 h～6 h)上調(diào)38次、下調(diào)11次;細(xì)胞增殖階段(PH后6 h～66 h)上調(diào)188次、下調(diào)110次;細(xì)胞分化和組織結(jié)構(gòu)功能重建階段(PH后72 h～168 h)上調(diào)58次、下調(diào)33次(圖1)?；虮磉_(dá)貫穿于整個(gè)肝再生過程。在0.5～2、30和60～66 h起始表達(dá)上調(diào)基因占優(yōu)勢(shì),在4、8～18、36～42和120 h起始表達(dá)下調(diào)基因占優(yōu)勢(shì),其他時(shí)點(diǎn)不再有基因起始表達(dá)。

圖1 81個(gè)氧及活性氧代謝相關(guān)基因在大鼠肝再生各時(shí)點(diǎn)起始表達(dá)及總表達(dá)情況Fig.1 The initial and total expression profiles of 81 genes associated with oxygen and reactive oxygen species metabolism at each time point of rat liver regeneration

2.3 氧及活性氧代謝相關(guān)基因在大鼠肝再生中表達(dá)方式

根據(jù)功能和在肝再生中變化將上述81個(gè)基因的表達(dá)方式分為6類(圖2)。①參與氧化反應(yīng)(根據(jù)參與氧化反應(yīng)中基因表達(dá)的相似性又分為1-a～1-g共7小類)。23個(gè)基因上調(diào),15個(gè)下調(diào),17個(gè)上/下調(diào);②參與谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)。4個(gè)上調(diào),2個(gè)上/下調(diào);③參與過氧化物合成。1個(gè)下調(diào);④參與過氧化物分解。2個(gè)上調(diào),1個(gè)下調(diào),1個(gè)上/下調(diào);⑤參與超氧化物釋放。2個(gè)下調(diào),3個(gè)上/下調(diào);⑥參與超氧化物清除。2個(gè)上調(diào)。

3 討論

在氧化反應(yīng)相關(guān)基因中,促進(jìn)活性氧合成的cyp1a1等3個(gè)基因幾乎在整個(gè)肝再生中表達(dá)上調(diào),通過抑制硫氧還蛋白的活性來(lái)調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的txnip等20個(gè)基因在肝再生早期表達(dá)上調(diào),保護(hù)細(xì)胞抗氧化的gsr等27個(gè)基因在肝再生中期表達(dá)上調(diào),維持氧化還原內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的btg1等3個(gè)基因在肝再生后期表達(dá)上調(diào),推測(cè)幾乎整個(gè)肝再生中氧化反應(yīng)加強(qiáng)。其中,cyp1a1在部分肝切除后0.5～24、36、48～72、120 h表達(dá)上調(diào),12 h達(dá)到高峰,是對(duì)照的59.7倍,推測(cè)它在再生肝的氧化反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

在谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)相關(guān)基因中,催化谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)并有解毒作用的gstm4等6個(gè)基因幾乎在整個(gè)肝再生中表達(dá)上調(diào)。推測(cè)谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)在肝再生中表達(dá)增強(qiáng)。其中,gstm4在1、18、48 h表達(dá)上調(diào),1 h達(dá)到高峰,是對(duì)照的7.5倍。推測(cè)它在再生肝的谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。

圖2 81個(gè)氧及活性氧代謝相關(guān)基因在大鼠肝再生中表達(dá)方式Fig.2 Expression patterns of 81 genes associated with oxygen and reactive oxygen species metabolism during rat liver regeneration

在過氧化氫代謝相關(guān)基因中,催化過氧化氫合成的duox2在肝再生早期和前期表達(dá)下調(diào),相應(yīng)時(shí)期分解過氧化氫的cat等4個(gè)基因表達(dá)上調(diào)。推測(cè)肝再生早期和前期過氧化氫代謝加強(qiáng)。

在超氧化物代謝相關(guān)基因中,促進(jìn)超氧化物釋放的alox12等5個(gè)基因和與過氧化物清除有關(guān)的mt3主要在肝再生早期和前期表達(dá)上調(diào)。推測(cè)肝再生相應(yīng)時(shí)期超氧化物代謝增強(qiáng)。其中,nox1在0.5～8、18、120 h表達(dá)上調(diào),2 h達(dá)到高峰,是對(duì)照的8.6倍。推測(cè)它在再生肝的超氧化物釋放中起關(guān)鍵作用。

綜上所述,本試驗(yàn)從較長(zhǎng)時(shí)間和較多時(shí)點(diǎn)入手,用高通量基因表達(dá)譜芯片從基因轉(zhuǎn)錄水平分析了部分肝切除后氧及活性氧代謝相關(guān)基因在肝再生中表達(dá)變化,初步證實(shí)肝再生早期和前期過氧化氫和超氧化物代謝加強(qiáng);幾乎在整個(gè)肝再生中氧化反應(yīng)和谷胱甘肽結(jié)合反應(yīng)增強(qiáng)。然而,從基因→mRNA→蛋白質(zhì)→功能等受包括蛋白互作在內(nèi)的多種因素影響,今后將進(jìn)一步用Northern blot、蛋白質(zhì)芯片、RNA干擾、蛋白互作等技術(shù)驗(yàn)證上述結(jié)果。

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