兔VX2肝癌模型的建立的綜述

朱妍

引言

惡性腫瘤嚴重威脅著人類的生命健康，而是否存在轉(zhuǎn)移是決定患者存活期和腫瘤治療成敗的主要因素。肝臟是惡性腫瘤最常見的轉(zhuǎn)移部位，據(jù)1905年～1973年的尸檢統(tǒng)計，因惡性腫瘤而死亡的病人中，有24%～36%的病人發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。Weiss等指出，其中結(jié)腸、直腸癌患者至少有20%將死于肝轉(zhuǎn)移[1]。因此，早期發(fā)現(xiàn)肝癌對腫瘤診治至關(guān)重要，可爭取手術(shù)機會，明顯延長患者生命。為了進一步探討肝臟腫瘤的影像學特征，需要建立一個類似人肝癌的動物模型，以期對其進行深入的基礎(chǔ)研究和臨床研究，可以預見這樣的動物模型對探討腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移機制、病理演變過程、早期診斷、治療等方面的研究均具有重要價值。

而這方面的實驗研究則要求采用較大的動物模型才更為合適。目前在較大動物建立的肝癌模型的報道尚少，兔肝VX2癌是少數(shù)建立在較大動物的肝癌復發(fā)轉(zhuǎn)移模型，是目前用于影像研究最為理想的肝癌實驗模型之一。近年來已有學者將其用于介入、高強度聚焦超聲、微波治療、新型肝臟特異性和血池型CT、MRI造影劑等的實驗研究，是目前用于影像研究最為理想的肝癌實驗模型之一。通過建立兔VX2肝癌模型，利用影像設(shè)備監(jiān)測兔VX2肝癌的生長、轉(zhuǎn)移情況，旨在進一步完善兔VX2肝癌模型及其影像學檢查方法，并將兔VX2肝癌各階段的MRI影像學表現(xiàn)與病理切片進行比較研究，促進人早期肝癌的診斷與治療[2-3]。

1 VX2瘤株簡介

在1930年后期，Kidd利用Shope病毒在兔子體內(nèi)誘發(fā)乳頭瘤，隨后轉(zhuǎn)化成鱗狀細胞癌，建立了可以植入兔子的許多部位和器官的兔VX2瘤種，從而成功地建立了兔子VX2腫瘤動物模型。實驗所用瘤株來源于Shope病毒致乳頭瘤惡變形成的上皮細胞惡性腫瘤，經(jīng)過72次傳代后正式建株，并可接種到兔肝臟、腎臟、肌肉、肺臟等部位，制成原位腫瘤動物模型[4-5]。

實驗一般采取兔VX2腫瘤模型的主要原因是:該腫瘤性質(zhì)穩(wěn)定，增殖迅速，短期內(nèi)即可發(fā)生廣泛壞死，并形成肝、肺轉(zhuǎn)移，故VX2腫瘤瘤株在大型動物模型的研究上具有很高的應用價值[6-7]。

2 動物模型的特點

兔腫瘤模型具有制作簡便易行，價格相對低廉，實驗周期短、成功率高、重復性好、模型性質(zhì)穩(wěn)定等特點。兔肝臟的左葉體積明顯大于右葉，左肝動脈較粗大，大多數(shù)從腹腔動脈直接發(fā)出，而右肝動脈較細。同時為了方便操作，避免栓塞材料等進入膽囊動脈引起不必要的并發(fā)癥。因此，研究VX2肝癌模型最好將懸液種植于肝左葉。雖其組織形態(tài)、生物學特性與原發(fā)性肝癌有所不同，而兔長期生存率不高，且兔VX2肝癌模型在短期內(nèi)即出現(xiàn)明顯的液化壞死等均不利于長期研究，但可用作有關(guān)肝癌治療學及肝癌影像學等的相關(guān)臨床前期研究[8]。

3 VX2瘤株的制備

首先，將VX2冰凍腫瘤細胞按一般細胞培養(yǎng)技術(shù)進行復蘇后800r/min離心5min，棄去上清液，加入PBS液再離心5min，再棄上清液后加入PBS液并用玻璃棒攪勻。取懸液置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)傳代，臺盼藍染色，將培養(yǎng)液調(diào)制成1×107/ml活細胞密度。取0.5ml接種于兔后腿外側(cè)肌肉內(nèi)，2周后可捫及后腿外側(cè)肌肉內(nèi)一實質(zhì)性包塊，說明荷瘤兔制作成功。傳代一般在2～4周左右進行，4周后瘤體多液化壞死，影響接種質(zhì)量。在無菌條件下將兔全麻后手術(shù)剝離荷瘤兔后腿肌肉內(nèi)腫塊，切開瘤體后取瘤細胞生長活躍的灰白色魚肉樣組織置于盛有生理鹽水(青霉素40萬U)的燒瓶中，剔除壞死組織及纖維組織，以便制成腫瘤懸液。用1ml注射器抽取1ml備用。當采用腫瘤組織塊直接接種法時則將從荷瘤兔體內(nèi)取出的生長活躍的腫瘤組織用手術(shù)剪剪碎至1～2mm3的小塊以便后續(xù)種植之用[9-12]。

4 兔VX2肝癌模型的建立

目前兔VX2肝癌模型的建立主要有3種方法:瘤細胞懸液經(jīng)肝包膜注入法、超聲穿刺接種，腫瘤組織塊直接接種法。

4.1 腫瘤組織塊直接接種法

將兔子全麻后無菌條件下逐層開腹，暴露肝臟，以眼科鑷于肝左中央葉較厚處刺破肝組織并形成口小(3～5mm)底大(5～8mm)的“燒瓶”樣竇道,將2～3塊剪碎的瘤株植入其中,并以明膠海綿碎塊埋塞竇口。確認止血后回納肝臟，逐層關(guān)腹。術(shù)中還應注意:(1)瘤株制備時要將壞死組織及纖維組織剔除干凈，以免影響成功率。(2)注意無菌操作，避免感染所致接種失敗。(3)塞入瘤株碎塊后，應以明膠海綿填塞竇口，一來可避免瘤塊溢出造成腹腔種植；二則可使瘤株盡可能種植在肝左葉深部，可使瘤灶靠近較大血管支易于獲得血供[13]。

4.2 超聲穿刺接種

常規(guī)肋下B超或CT掃查待接種兔肝臟，明確兔肝位置并確定待接種部位，選定穿刺點、角度、深度。常規(guī)消毒鋪巾，尖刀挑開穿刺點皮膚(術(shù)后瘢痕點可作為B超或CT監(jiān)測移植瘤的部位)，用帶尖頭穿刺針芯穿刺針沿設(shè)定的穿刺角度、方向穿入預定肝位置，助手固定好穿刺針，術(shù)者拔出針芯，眼科鑷夾1塊瘤塊放入針鞘內(nèi)，平頭穿刺針芯將瘤塊推入肝內(nèi)，重復1～2次。在直視下來回在針鞘內(nèi)推動平頭穿刺針芯，證實瘤塊接種于肝臟。如未成功，可再重復上述操作。術(shù)后連續(xù)3天青霉素40萬U+慶大霉素4萬U肌注。采用直接穿刺法復制出的VX2兔肝癌模型具有方法簡單、成功率高、模型性質(zhì)穩(wěn)定的特點。同常規(guī)開腹接種法相比具有以下優(yōu)點:不需開腹，無開腹接種法常伴的出血多、損傷大、術(shù)中兔麻醉過淺不易操作，麻醉過深易致意外死亡；術(shù)后手術(shù)瘢痕影響超聲監(jiān)測等缺點。同懸液注射法相比:形成的腫瘤為孤立結(jié)節(jié)型而非彌漫性腫瘤，便于進行肝癌的影像學研究，無腹腔種植，并且可根據(jù)研究需要調(diào)整模型腫瘤在肝的位置。不過，由于兔肝小移動性較大且分葉多，故在選兔時一般選擇體型較大的兔，為提高穿刺接種成功率，要求尖頭穿刺針芯銳利，平頭穿刺針芯直徑與外套針內(nèi)徑吻合，長度略長于外套針；穿刺時需一定的技巧:先用尖刀挑開擬穿刺處皮膚，再進針。進針要求快、防止瘤塊接種于肝葉之間的空隙中[14]。

4.3 瘤細胞懸液經(jīng)肝包膜注入法

實驗兔術(shù)前12小時內(nèi)禁食不禁飲。用麻醉藥經(jīng)耳緣靜脈麻醉后，將實驗兔仰臥，四肢固定，上腹部常規(guī)剃毛，按外科無菌程序消毒術(shù)區(qū)皮膚，鋪無菌巾，于劍突下稍偏左約1cm作一4～5cm切口，切開皮膚，分離肌肉、筋膜，打開腹腔，暴露肝臟。挑開肝包膜，將1mlVX2腫瘤細胞懸液用16號針頭注人肝實質(zhì)內(nèi)，壓迫止血。注意注射時速度應緩慢，避免推注壓力過大，懸液外滲引起腹腔內(nèi)種植。另外盡量使腫瘤種植在肝葉深部，可使瘤灶靠近較大血管支易于獲得血供。拔針后立即用直徑約1.0cm的生理鹽水棉球輕壓針眼表面至徹底止血，4～6s后將肝臟回納入腹腔，逐層縫合腹壁傷口。待種植兔復蘇后，于動物實驗室隔離飼養(yǎng)。術(shù)后連續(xù)3天青霉素40萬U+慶大霉素4萬U肌注[15-17]。

5 兔VX2肝癌模型的應用

兔VX2腫瘤是迄今為止唯一能夠在較大動物建立的肝轉(zhuǎn)移性腫瘤模型，該模型多用于肝臟腫瘤的影像學和治療學研究。實驗動物在短期內(nèi)均能長出孤立的肝臟腫瘤，復制出的肝臟腫瘤在對分析兔肝VX2腫瘤的病理過程及發(fā)生轉(zhuǎn)移的機理也有重要意義，對指導臨床選擇腫瘤治療方案也有指導意義。文獻顯示7天時腫瘤尚處于腫瘤血管生成前期，此時進行抗腫瘤血管生成治療效果特佳；14天時腫瘤體積較小，此階段為供瘤血管形成期，肝功能變化不大，無肝外轉(zhuǎn)移，可作為早期肝癌模型；接種后21天，相對于動物肝臟體積腫瘤己較大，瘤中心出現(xiàn)變性壞死出血，此階段為供瘤血管穩(wěn)定期，肝功能己有明顯變化，但轉(zhuǎn)移尚不多見，可作為進展期肝癌的研究模型；接種后28～35天腫瘤進一步增大，中心變性壞死增多，且多數(shù)已出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，可作為較晚期肝癌的動物模型，此階段為供瘤血管退化期，血管增生相對減慢，瘤體大部分壞死[18-19]。故進行腫瘤傳代以14～21天為宜，以免腫瘤壞死和轉(zhuǎn)移影響實驗結(jié)果。

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