鴨疫里氏桿菌分子生物學(xué)研究進(jìn)展*

劉佳麗,張喜宏,姜英武,谷春華,高云航*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,吉林長春130118;2.吉林省敦化市牧業(yè)管理局,吉林敦化133700)

鴨疫里氏桿菌病又稱鴨傳染性漿膜炎,是一種由鴨疫里氏桿菌(Riemerella anatipestifer,RA)感染引起家鴨、鵝、火雞等多種家禽廣泛性纖維素性滲出為特征的急性或慢性傳染病。亦有報(bào)道從野禽和家養(yǎng)豬中分離到本菌[1]。本病目前呈全球性發(fā)生,發(fā)病率和病死率均較高,對養(yǎng)鴨業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。RA血清型眾多,且各血清型之間無交叉保護(hù)力。目前公認(rèn)有21個(gè)型(1～21型),并不斷有新的血清型被發(fā)現(xiàn)[2]。目前國內(nèi)外學(xué)者均致力于本病致病機(jī)理、耐藥機(jī)理、免疫原性等病原分子生物學(xué)方面研究。

1 毒力相關(guān)基因的研究

RA感染是一個(gè)復(fù)雜、動態(tài)的多因子作用過程,涉及眾多毒力基因產(chǎn)物即毒力因子的協(xié)同作用。目前國內(nèi)外對毒力相關(guān)基因研究尚處于起步階段。

1.1 質(zhì)粒

Chang C F等[3]首次報(bào)道大部分RA菌株含有質(zhì)粒,并將其中一個(gè)3.9 kb的質(zhì)粒命名為pCFC1,包含4個(gè)長的開放閱讀框(ORF)即VapD1、VapD2、RepA1和RepA2。其中VapD1和VapD2編碼的蛋白質(zhì)與毒力有關(guān),并且證明VapD1序列僅存在于含質(zhì)粒的RA菌株中。Weng S C等[4]從大小為5.6 kb的質(zhì)粒pCFC2中發(fā)現(xiàn)一個(gè)插入序列元件ISRal,為編碼毒力相關(guān)類蛋白基因,并且為首次在革蘭陰性菌中發(fā)現(xiàn)的插入序列。

1.2 環(huán)化腺苷-磷酸溶血素-唾液酸蛋白酶

Crasta K C等[5]建立了RA基因文庫,通過金黃色葡萄球菌進(jìn)行環(huán)化腺甘-磷酸CAMP反應(yīng)篩選陽性克隆,獲得協(xié)同溶血素基因cam,并證明其為一種中性金屬蛋白基因,經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析,表達(dá)產(chǎn)物為37 ku的唾液酸蛋白酶。CAMP可能為RA毒力決定因子,其cam基因?yàn)樗蠷A毒株所共有。CAMP活性可被螯合劑等抑制,具有免疫原性,并可協(xié)同產(chǎn)生溶血作用。

1.3 二肽肽酶Ⅳ(dppⅣ)及鋅依賴肽酶(zdp)

鄭娟[6]用選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列(SCOTS)技術(shù)篩選1型鴨疫里氏桿菌(RA-YM)在感染過程中特異性表達(dá)基因,篩選到2個(gè)編碼蛋白酶的基因,即二肽肽酶Ⅳ(dppⅣ)和鋅依賴肽酶(zdp)。推測二肽肽酶Ⅳ可能為RA引起主要病理變化——腹腔漿膜面廣泛性纖維素性滲出的關(guān)鍵性毒力因子之一。

1.4 Ⅰ型磷酸二酯酶(PDE1)基因

陳虹[7]應(yīng)用血清Ⅰ型RA CH-1株表達(dá)型DNA文庫進(jìn)行免疫篩選,篩選出一段4 434 bp的插入DNA片段。同源性分析表明,該基因是一種新的Ⅰ型磷酸二酯酶(PDE1)基因,對其進(jìn)行重組及原核表達(dá),誘導(dǎo)表達(dá)出大小約為80 ku的PDE1重組蛋白。免疫印跡檢測結(jié)果表明該重組表達(dá)蛋白具有較好的免疫原性。

1.5 明膠水解酶

多種細(xì)菌分泌的具有水解明膠活性的胞外蛋白酶與致病性有關(guān),為重要毒力因子。RA部分菌株具有液化明膠特性。唐妤[8]對RA部分特性研究,RA明膠水解粗酶對試驗(yàn)鴨肝臟、大腦、心臟、脾臟可以造成一定病理性損傷。李繼祥等[9]從RA AF株培養(yǎng)濾液中分離獲得能水解明膠及改變細(xì)胞形態(tài)的活性蛋白質(zhì),分子質(zhì)量約為55 ku,證實(shí)為降解明膠的蛋白水解酶,是鴨疫里氏桿菌培養(yǎng)濾液影響鴨胚成纖維細(xì)胞形態(tài)的活性物質(zhì),可能是細(xì)菌毒力因子之一。

1.6 熱休克蛋白Hsp20和轉(zhuǎn)座酶

劉燕等[10]應(yīng)用雙向電泳及質(zhì)譜技術(shù)對血清2型鴨疫里氏桿菌強(qiáng)毒株及其體外傳代200代(RA200)的弱毒菌株外膜蛋白進(jìn)行比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究,獲得重復(fù)性好的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)3個(gè),經(jīng)膠內(nèi)酶解和肽質(zhì)量指紋圖譜分析,W1為熱休克蛋白Hsp20家族成員,W2、W3為轉(zhuǎn)座酶,推測它們可能與里氏桿菌的毒力密切相關(guān)。

2 耐藥相關(guān)因子的研究

細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生機(jī)制分為自發(fā)性基因突變和耐藥基因摻入,細(xì)菌耐藥基因不僅由其染色體攜帶,還常由染色體外的質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子(transposon,Tn)或整合子(integron,int)攜帶,通過融合、轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化在不同種屬的遺傳物質(zhì)之間轉(zhuǎn)移或集聚重排造成多重耐藥菌發(fā)生率大幅上升。從臨床實(shí)踐可以看出,由于大量抗生素及抗菌藥用于治療鴨疫里氏桿菌病,造成鴨RA耐藥現(xiàn)象日益增多,耐藥率高且廣泛,交叉耐藥性多[11]。

2.1 氨基糖苷類修飾酶-3′核苷轉(zhuǎn)移酶I

劉穎等[12]首次在RA中檢測出了氨基糖苷類修飾酶——3′核苷轉(zhuǎn)移酶Ⅰ(ant(3′)-Ⅰ)基因,產(chǎn)生氨基糖苷類耐藥的基因是通過氨基糖苷類修飾酶(AMES)對進(jìn)入胞內(nèi)的活性分子進(jìn)行修飾使之失去生物活性。此研究對RA產(chǎn)生氨基糖苷類抗生素耐藥的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

2.2 螺旋酶gyrA

劉穎等[13]用PCR技術(shù)擴(kuò)增26株RA的部分螺旋酶gyrA序列,通過與大腸埃希菌(ABA36537)比較氨基酸序列找到了對喹諾酮類抗菌藥耐藥菌株的基因突變點(diǎn)和突變規(guī)律,為研究RA對喹諾酮類抗菌藥耐藥的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。孫亞妮[14]對臨床分離的31株RA,對其螺旋酶區(qū)進(jìn)行測序,尋找RA對喹諾酮類抗菌藥耐藥菌株的gyrAQDRD突變熱點(diǎn)和突變規(guī)律。結(jié)果表明,31株諾氟沙星耐藥菌株均出現(xiàn)了gyrA基因突變,而環(huán)丙沙星耐藥菌株基因突變沒有明顯規(guī)律性。

2.3 基因盒-整合子系統(tǒng)

蔡秀磊[15]應(yīng)用PCR技術(shù)對鴨疫里氏桿菌浙江分離株進(jìn)行基因盒-整合子系統(tǒng)檢測。從分子水平上研究該菌耐藥性產(chǎn)生與傳播機(jī)制。整合子可變區(qū)擴(kuò)增得到兩種大小不同基因盒,長度分別為1 048 bp(InI-A)和2 352 bp(InI-B)。InI-A中含有一個(gè)耐藥基因盒aadA5基因,編碼核苷轉(zhuǎn)移酶,導(dǎo)致細(xì)菌對氨基糖甙類藥物產(chǎn)生耐藥性。InI-B含有長度為555 bp的aac6-Ⅱ基因,編碼?；D(zhuǎn)移酶,引起細(xì)菌對氨基糖苷類藥物耐藥;長度為633 bp的catB3基因,編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶,介導(dǎo)對氯霉素產(chǎn)生耐藥性;長度為792 bp的aadA1基因,編碼核苷轉(zhuǎn)移酶,介導(dǎo)對氨基糖苷類藥物耐藥。以上結(jié)果表明,RA存在與其他細(xì)菌同源性極高的Ⅰ型整合子結(jié)構(gòu),推測認(rèn)為與分離菌株多重耐藥性有關(guān)。

2.4 生物膜的研究

很多微生物的耐藥性與生物膜的產(chǎn)生息息相關(guān)[16]。Hu Q H等[17]發(fā)現(xiàn),RA中的生物膜對抗生素和去污劑有很好的抵抗作用,同時(shí)認(rèn)為生物膜的產(chǎn)生是造成RA持續(xù)感染的重要因素。

2.5 雙耐藥RA融合菌株的構(gòu)建

蔡良水[18]采用原生質(zhì)體融合技術(shù)構(gòu)建雙耐藥RA融合菌株,分別選用氯霉素(Chi)和紅霉素(Ery)對RA-JX菌株(l型)和RA-2菌株(2型)進(jìn)行耐藥性標(biāo)記,分別獲得遺傳特性穩(wěn)定的耐藥性標(biāo)記菌株RAC(Chlr,Erys)(1型)和RAE(Eryr,Chls)(2型)。鴨疫里氏桿菌血清1型和2型雙耐藥融合菌株的成功構(gòu)建,為鴨疫里氏桿菌新型疫苗的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

3 DNA指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用

Rimler R B等[19]將17種限制性核酸內(nèi)切酶用于RA的DNA指紋圖譜研究,發(fā)現(xiàn)不同來源RA基因存在明顯差異,即使來自同一地區(qū)同一禽類的分離株相同血清型RA菌株,其DNA指紋圖譜也有所不同。Huang B等[20]通過回文結(jié)構(gòu)序列PCR(repetitive sequence based-PCR,Rep-PCR),以基因外重復(fù)回文序列為引物,對18個(gè)血清型35株RA進(jìn)行基因外重復(fù),發(fā)現(xiàn)不同血清型Rep-PCR指紋圖譜呈現(xiàn)多態(tài)性,相同血清型而流行病學(xué)上不相關(guān)的菌株經(jīng)Rep-PCR擴(kuò)增后的指紋圖譜也存在不同。結(jié)果表明Rep-PCR技術(shù)也許可以成為對RA血清亞型鑒定的一種分子工具。程龍飛等[21]以Rep-PCR技術(shù),將分屬于8個(gè)血清型40株RA區(qū)分為12個(gè)不同基因型,不同血清型RA圖譜有明顯差異,相同血清型RA圖譜也有所不同。

4 16 S rDNA特性分析

Subramaniam S等[22]通過對4株RA編碼16 S rRNA的基因序列進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)其基因序列相似,同源性高達(dá)99%～99.5%。其16 S rRNA基因經(jīng)限制性酶切片段長度多態(tài)性分析(RFLP)表明即使是同一血清型不同RA菌株,其16 S rRNA基因仍有差異。

5 RA相關(guān)免疫蛋白

RA免疫相關(guān)蛋白的研究主要集中在莢膜蛋白和外膜蛋白(OmpA)。

5.1 莢膜蛋白

蘇敬良等[23]對1型RA莢膜提取物免疫原性結(jié)果表明,莢膜粗提物和經(jīng)過苯酚抽提純化后的莢膜提取物均能有效刺激鴨機(jī)體產(chǎn)生抗體,對同源細(xì)菌攻毒保護(hù)率分別為90%和70%。粗提莢膜可直接誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng),而莢膜多糖分子純化過程中構(gòu)型可能發(fā)生改變,從而影響其免疫原性。齊冬梅等[24]用鹽浸法提取I型RA莢膜粗提物并制成油佐劑疫苗,獲得較好免疫保護(hù)效果(9/10)。

5.2 外膜蛋白

朱德康[25]對5種血清型RA外膜蛋白(OmpA)SDS-PAGE圖譜比較分析結(jié)果表明,其外膜蛋白電泳圖譜具有一定相似性,不同血清型菌株外膜蛋白之間存在交叉免疫原性,74 ku和31 ku外膜蛋白是重要交叉免疫原性蛋白。程安春等[26]采用超聲波裂解法和超速離心法提取血清2型RA外膜蛋白,經(jīng)過透射電鏡觀察、免疫印跡證實(shí),血清2型RA 40 ku外膜蛋白為主要免疫原蛋白,用分離的外膜蛋白加上弗氏佐劑制備的亞單位疫苗免疫雛鴨后,可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體。劉文華等[27]等利用PCR技術(shù)擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)血清2型RA 42 000外膜蛋白基因片段(OmpA-2)1 045 bp,并將其克隆和表達(dá),獲得分子質(zhì)量約為65 ku融合表達(dá)蛋白。霍翠梅等[28]參照已知RA OmpA序列設(shè)計(jì)1對特異性引物,經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的片段約1 200 bp,經(jīng)測序與標(biāo)準(zhǔn)序列核苷酸同源性達(dá)99.8%;誘導(dǎo)表達(dá)后,經(jīng)SDS-PAGE分析表明,OmpA獲得高效表達(dá),Western blot檢測發(fā)現(xiàn)與1、2、10、11型全菌兔血清呈陽性,而與陰性兔血清不反應(yīng),說明表達(dá)蛋白具有高度免疫反應(yīng)特異性。

6 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)

汪銘書等[29]以4株不同血清型RA、5株不同血清型鴨源致病性大腸埃希菌和5株同一血清型鴨沙門菌為研究對象,利用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)對其基因組DNA進(jìn)行分析,篩選出一條引物G12,結(jié)果顯示電泳圖譜中535 bp的條帶為鴨疫里氏桿菌所特有,330 bp條帶為沙門菌所特有,1 227 bp條帶為大腸埃希菌所特有,表明G12可作為分子標(biāo)記用來鑒別3種細(xì)菌。

7 單克隆抗體的制備

覃志初等[30]首次嘗試RA單克隆抗體(McAb)的研制,成功的研制出RA外膜蛋白McAb,并建立了靈敏度高、特異性好的RA單克隆抗體篩選方法,為RA單克隆抗體在鴨傳染性漿膜炎的防治及相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。

8 基因文庫的構(gòu)建

目前關(guān)于RA基因文庫構(gòu)建的研究較少,僅對1型、2型RA進(jìn)行部分基因庫構(gòu)建,具有一定成效,可為進(jìn)一步研究RA的致病和耐藥機(jī)制提供依據(jù)。

朱德康等[31]以血清1型RA CH21株為材料,成功構(gòu)建其部分基因組文庫,研究發(fā)現(xiàn)其含有1個(gè)編碼369個(gè)氨基酸的完整開放閱讀框架,為尚未見報(bào)道的RA基因序列,且存在多個(gè)預(yù)測抗原表位。吳芳等[32]以RA 2型毒力株RA F2及弱毒力株LY-58為研究對象,通過抑制性差減雜交(SSH)技術(shù),構(gòu)建DNA差減文庫,從RA F2株中獲得14個(gè)特異性差異基因片段。經(jīng)同源性分析,其中6個(gè)差異基因片段分別與外膜蛋白、ATP結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、氨基酸通透酶、胞外蛋白編碼基因具有同源性,為可能毒力基因。利用PCR對差異基因片段在不同血清型RA中的分布進(jìn)行檢測,結(jié)果表明,除8型外,以上差異基因片段在RA中分布普遍。

9 原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體比較特殊,外源DNA比較容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),制備原生質(zhì)體后再進(jìn)行轉(zhuǎn)化是一個(gè)非常好的選擇,特別對于那些難以轉(zhuǎn)化的細(xì)菌來說提供了一條新途徑,轉(zhuǎn)化成功的關(guān)鍵在于原生質(zhì)體的制備。RA是一種非常難以轉(zhuǎn)化的細(xì)菌,國內(nèi)外未見關(guān)于其質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的報(bào)道。王勇等[33]試驗(yàn)以鴨疫里氏桿菌OD600為0.7時(shí)為受體菌,在高滲緩沖液中,經(jīng)溶菌酶5 mg/mL于37℃作用50 min,制備的原生質(zhì)體再生于再生雙層固體培養(yǎng)基,原生質(zhì)體成功再生。此研究為RA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化提供了一條新途徑。王春平等[34]以耐藥標(biāo)記的RA TXRA1(Chlr,Erys)為親本菌株,在DNase I始終存在的條件下,采用Lysozyme-EDTA法制備原生質(zhì)體,然后在高滲瓊脂平板上再生,成功獲得了92%的原生質(zhì)體制備率和38.77%的再生率。

10 噬菌體技術(shù)的應(yīng)用

程龍飛等[35]探索RA生物學(xué)療法,對健康番鴨糞便進(jìn)行分離富集,獲得1株RA敏感的烈性噬菌體,命名為RA P15。該噬菌體可裂解2株鴨疫里氏桿菌(RA f6和RA f71),說明噬菌譜較窄。透射電鏡觀察顯示,該噬菌體由呈多面體的頭部(直徑約55 nm)和細(xì)長的尾部(長約200 nm)組成。RA P15基因組可以被DNaseⅠ消化,但不能被RNaseA和綠豆核酸酶消化,提示其核酸類型為雙股DNA。形態(tài)學(xué)和分子特征提示,RA P15屬于長尾病毒科。

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