糖尿病腎病診斷生物標(biāo)志物研究新進(jìn)展

(東南大學(xué)腎臟病研究所，東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院腎科，江蘇南京 210009)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病主要的微血管并發(fā)癥，以持續(xù)蛋白尿、腎功能進(jìn)行性下降和高心血管疾病發(fā)病率及死亡率為特征［1］。據(jù)估計(jì)，2030年全世界糖尿病患者數(shù)量將從2000年的1.71億增加到3.66億，其中30% ～40%的2型糖尿病將發(fā)展為DN，20% ～40%的1型糖尿病15～30年后也將發(fā)展為DN［2］，DN已成為引起終末期腎衰最常見的原因之一。如何早期發(fā)現(xiàn)DN，并進(jìn)行早期干預(yù)是臨床上迫切需要解決的問題。盡管腎活檢是早期明確診斷DN的金標(biāo)準(zhǔn)，但作為一項(xiàng)創(chuàng)傷性和技術(shù)復(fù)雜的檢查，它難以普及和臨床反復(fù)進(jìn)行。因此積極尋找DN早期診斷生物標(biāo)志物(biomarker)將具有非常重要的臨床意義，為此國內(nèi)外近年來進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究，作者簡要綜述有關(guān)進(jìn)展。

1 DN診斷中的生物標(biāo)志物

1.1 微量白蛋白尿(microalbuminuria，Malb)

長期以來，DN早期診斷臨床上主要依賴Malb測定。正常情況下，腎小球?yàn)V過膜存在電荷選擇性屏障，在靜電同性排斥作用下，絕大多數(shù)的白蛋白不能通過濾過膜。而在DN早期，由于腎小球?yàn)V過膜帶負(fù)電荷的乙酰硫酸肝素、唾液酸等成分減少，使腎小球?yàn)V過膜的電荷選擇性降低，并干擾了蛋白多糖與細(xì)胞外基質(zhì)間親和力。此外，最近研究表明高糖環(huán)境可致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞外被的多糖蛋白復(fù)合物受到破壞，致使腎小球?yàn)V過膜上濾孔孔徑增大以及腎小球?yàn)V過膜富含帶負(fù)電荷的結(jié)構(gòu)成分改變［3-4］;細(xì)胞因子和生長因子通過多途徑改變血流動力學(xué)應(yīng)力導(dǎo)致DN結(jié)構(gòu)改變，足細(xì)胞增寬伴隨每個腎小球足細(xì)胞數(shù)量減少，從而導(dǎo)致白蛋白在尿中排出增多。Sampaio等［5］應(yīng)用免疫比濁法對293例糖尿病患者進(jìn)行橫斷面研究表明，當(dāng)尿白蛋白濃度(UAC)界定值為22 mg·L-1時，敏感性為82.5%，特異性為74%，當(dāng)尿白蛋白/尿肌酐(UACR)界定值為27.3 mg·g-1時，敏感性為83.3%，特異性為80.9%。而UAC低界定值(10 mg·L-1)雖然其敏感性提高(94.2%)，但特異性顯著降低(48.6%)，UACR也是如此。研究表明，UAC和UACR在反映Malb水平的變化中其精確性相似，對1型和2型DN診斷的敏感性也無差異。

大多數(shù)研究認(rèn)為，Malb程度與DN的預(yù)后密切相關(guān)。日本學(xué)者通過對5 449例糖尿病患者進(jìn)行5年隨訪，監(jiān)測其尿白蛋白與肌酐的比值(ACR)，發(fā)現(xiàn)ACR升高即使只在正常高限，也可預(yù)測腎小球?yàn)V過率估測值(eGFR)的下降［6］。但是，最近研究發(fā)現(xiàn)，只有30%～45%的Malb患者在10年內(nèi)會進(jìn)展為蛋白尿［7］，而且，臨床許多情況下(如運(yùn)動、發(fā)熱、原發(fā)性腎臟病、感染等)Malb也可以顯著升高。因此，Malb作為DN診斷生物標(biāo)志物其特異性和對疾病嚴(yán)重程度的預(yù)測價(jià)值受到質(zhì)疑。

1.2 免疫球蛋白(IgG和IgM)

IgG是血液中主要免疫球蛋白，多數(shù)以單體形式存在，主要由脾和淋巴結(jié)合成，不經(jīng)腎小球?yàn)V過，故正常人尿液中含量極低。日本學(xué)者認(rèn)為IgG升高范圍與腎小球破壞程度呈正相關(guān)，且在DN早期，Malb正常時IgG已明顯升高，對早期DN診斷有意義。IgG 4個亞型中IgG4帶負(fù)電荷，當(dāng)電荷屏障受損時，可見IgG4與白蛋白排泄率呈正相關(guān)，特別是IgG4/IgG之值意義更大，在DN晚期，由于腎小球機(jī)械屏障損害，IgG排出增多，IgG4/IgG之值下降。因此IgG4、IgG4/IgG之值可反映早期DN電荷屏障的損害。

IgM是分子量較大的免疫球蛋白(分子量為120?)，尿中IgM的出現(xiàn)往往反映腎小球?yàn)V過屏障嚴(yán)重受損［8］。Rafid等［9］對139例1型糖尿病患者進(jìn)行了長期隨訪(平均隨訪期18年)，發(fā)現(xiàn)患者的生存率和腎臟存活率與白蛋白排泄(RR=2.9/5.8)和尿IgM排泄有關(guān)(RR=4.6/5.7)，分層分析提示，不同程度的蛋白尿患者心血管疾病的死亡率和ESRD的發(fā)生率隨著尿IgM排泄的增多風(fēng)險(xiǎn)顯著增高(3倍左右)。DN患者無論是早期還是晚期，尿液IgM排泄增加，其心血管病死亡率和腎衰的風(fēng)險(xiǎn)性均顯著提高，提示尿液IgM的排泄是DN患者心血管疾病死亡率及ESRD獨(dú)立預(yù)測因子。

1.3 尿足細(xì)胞相關(guān)生物標(biāo)志物

最近大量研究表明，足細(xì)胞損害在DN發(fā)生發(fā)展中起非常關(guān)鍵的作用。一方面，DN進(jìn)展過程中高糖、高血脂、糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)、活性氧簇(ROS)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和機(jī)械應(yīng)力的增加對足細(xì)胞直接造成損傷，導(dǎo)致足細(xì)胞密度減少、體積增大和足細(xì)胞特異性蛋白表達(dá)改變［10］;另一方面，足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過屏障的重要組成成分，其形態(tài)結(jié)構(gòu)及相關(guān)分子改變必然促進(jìn)蛋白尿的發(fā)生［11］。Jennifer等［12］通過對 OVE26 轉(zhuǎn)基因糖尿病大鼠研究發(fā)現(xiàn)，足細(xì)胞改變可能在DN失代償期才增加濾過屏障的通透性。

足細(xì)胞位于腎小球毛細(xì)血管外側(cè)，故當(dāng)腎小球受損時足細(xì)胞脫離腎小球基底膜，在尿中可檢測到。有學(xué)者認(rèn)為，尿液中足細(xì)胞檢測有助于對腎小球損傷嚴(yán)重程度的判斷，但其技術(shù)復(fù)雜。近年來人們通過對足細(xì)胞標(biāo)記蛋白和基因的檢測，有可能更加便捷地了解DN不同階段足細(xì)胞的損害。

nephrin是裂孔隔膜上發(fā)現(xiàn)的第一個跨膜蛋白，由足細(xì)胞表達(dá)、構(gòu)成裂孔隔膜拉鏈樣結(jié)構(gòu)，與podocin、CD2AP組成復(fù)合體，維持裂孔隔膜結(jié)構(gòu)的完整，阻止蛋白濾出。研究發(fā)現(xiàn)，DN患者腎小球nephrin mRNA表達(dá)減少，引起足細(xì)胞損傷脫落，濾過屏障功能破壞，通透性增加，尿蛋白排出增加［13］。Wang 等［14］通過檢測DN患者尿沉渣中足細(xì)胞相關(guān)分子(nephrin、podocin和synaptopodin)的mRNA，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)升高，應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)和AngⅡ受體阻滯劑(ARB)治療后，逆轉(zhuǎn)錄定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRTPCR)證實(shí)尿液沉渣中nephrin mRNA排泄減少，尿液中podocin表達(dá)的改變可能與DN預(yù)后有關(guān)［15］。

1.4 尿Smad1

DN最主要的形態(tài)學(xué)改變是腎小球基底膜(GBM)增厚和系膜基質(zhì)擴(kuò)張，Takeshi等［16］在體外實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，Smad1作為膠原4中α1和α2的轉(zhuǎn)錄因子可以上調(diào)膠原4的表達(dá)，活化腎小球硬化相關(guān)分子如膠原特異性伴侶熱休克蛋白47、骨橋蛋白、1型膠原、α-SMA等。鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在24周系膜基質(zhì)擴(kuò)張，腎小球Smad1表達(dá)升高與系膜基質(zhì)擴(kuò)張程度一致。腎小球Smad1表達(dá)與腎小球膠原4和α-SMA表達(dá)一致，而蛋白尿、GFR與系膜基質(zhì)擴(kuò)張無關(guān)。表明Smad1可以上調(diào)膠原4和α-SMA的表達(dá)，而膠原4是系膜基質(zhì)擴(kuò)張的重要組成物質(zhì)，因此Smad1在DN系膜基質(zhì)擴(kuò)張中起重要作用。他們認(rèn)為Smad1可能比Malb更好地預(yù)測DN的系膜基質(zhì)擴(kuò)張，可以作為DN系膜基質(zhì)擴(kuò)張的診斷標(biāo)志物。

Akira等［17］對STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠和db/db糖尿病大鼠尿液Smad1水平進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)4周時小鼠尿Smad1水平與24周時系膜基質(zhì)擴(kuò)張相關(guān)，而蛋白尿與系膜基質(zhì)擴(kuò)張無明顯相關(guān)。Olmesartan(奧美沙坦)治療可顯著改善腎小球硬化和降低尿Smad1水平。同樣地，在db/db大鼠，6周時尿Smad1與18周時系膜基質(zhì)擴(kuò)張有關(guān)。因此認(rèn)為糖尿病早期階段尿液Smad1的增加與腎小球硬化有關(guān)，Smad1可作為新標(biāo)志物預(yù)示DN晚期出現(xiàn)的系膜擴(kuò)張。

雖然很多報(bào)道都提及Smad1的激活機(jī)制，但是只有相當(dāng)少的報(bào)道提示相關(guān)因子可以上調(diào)Smad1的表達(dá)，如AGEs與糖尿病腎小球Smad1的表達(dá)呈正相關(guān)［16］。Takeshi等［16］同樣發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠中腎小球TGF-β和激活素受體樣激酶-1(ALK-1)的表達(dá)增加，但是沒有發(fā)現(xiàn)TGF-β和ALK-1與腎小球Smad1表達(dá)有直接關(guān)系。

1.5 尿液炎癥標(biāo)志物

傳統(tǒng)認(rèn)為代謝和血流動力學(xué)改變是導(dǎo)致DN損傷的主要原因，現(xiàn)在越來越多的證據(jù)表明，炎癥因子介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在DN發(fā)展進(jìn)程中起重要作用［18］。多種細(xì)胞，包括白細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，還有其他一些分子如趨化因子(單核細(xì)胞趨化蛋白-1，MCP-1)、黏附分子(細(xì)胞間黏附分子-1，ICAM-1)、酶類(環(huán)氧酶-2，COX-2;一氧化氮合酶，NOs)、炎癥因子(血管內(nèi)皮生長因子，VEGF;生長激素，GH;胰島素樣生長因子，IGF;TGF-β)和核因子(核因子-κB，NF-κB)都與 DN進(jìn)程有關(guān)［19-21］，但是炎癥因子對糖尿病患者腎損傷的作用機(jī)制知之甚少。在眾多的炎癥因子中白介素(IL)-1、IL-6、IL-18和TNF-α與DN進(jìn)展的關(guān)系較為明確［21］，其對DN并發(fā)癥的進(jìn)展也有多種作用，它們在微血管病變中有時甚至起著決定性的作用［22-23］。此外，流行病學(xué)調(diào)查顯示炎癥參數(shù)可以很好地預(yù)測DN進(jìn)展。

Wolkow等［24］用Luminex 100 platform聯(lián)合酶聯(lián)免疫法(ELISA)的方法檢測1型糖尿病合并Malb患者尿液標(biāo)本中 IL-8、干擾素 γ誘導(dǎo)蛋白-10(IP-10)、MCP-1、IL-6、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1δ(MIP-1δ)5 種尿炎癥標(biāo)志物，發(fā)現(xiàn)腎功能下降者上述5種炎癥因子的濃度均高于腎功能正常者。多變量分析提示，兩種標(biāo)志物同時升高時腎功能受損的風(fēng)險(xiǎn)會增加5倍。提示腎臟炎癥在1型DN的進(jìn)展中起重要作用。

Tesch［25］認(rèn)為 MCP-1/CCL-2 是 DN 腎臟炎癥、損傷、纖維化的始動者，尿MCP-1水平可以用來評估糖尿病腎臟炎癥程度，可能對新療法或聯(lián)合治療效果評估有診斷價(jià)值［26］。此外，在嚙齒動物上做的基因缺失和分子阻斷實(shí)驗(yàn)證實(shí)MCP-1是阻斷2型糖尿病進(jìn)展的重要治療目標(biāo)。還有證據(jù)表明人類MCP-1基因多態(tài)性與DN進(jìn)展密切相關(guān)，這可能預(yù)示這些基因是DN的危險(xiǎn)因素［27］。

2 DN診斷中的新技術(shù)-蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)

以蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為手段，比較正常腎臟組織與病變腎臟組織中蛋白質(zhì)水平的差異，或健康者尿樣/血漿與腎臟病患者尿樣/血漿中蛋白質(zhì)水平差異，大大提高了DN診斷的陽性率，并有助于理解病理生理學(xué)機(jī)制。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)包括蛋白質(zhì)分離和鑒定技術(shù)。二維凝膠電泳(2-DE)是蛋白質(zhì)分離的基本方法，電噴霧質(zhì)譜(ESI-MS)和互助輔助激光解吸、離飛行質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)是蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)，它的特點(diǎn)是高靈敏度、快速、直接提供樣品的分子量和結(jié)構(gòu)信息并可與色譜連用。Kiga等［28］利用這一技術(shù)觀察到，在2 000～10 000 Da范圍內(nèi)伴有DN的自發(fā)性糖尿病WBN/Kob大鼠血漿中顯示80個峰，與對照的Wistar大鼠相比，其中質(zhì)量電荷比(m/z)為4 678、4 732、4 808、9 058、9 323 和9 465 的蛋白峰強(qiáng)度高，使用Hachimi-jio-gan后血糖水平?jīng)]有改變而DN改善，上述差異表達(dá)蛋白質(zhì)峰同時發(fā)生改變，而m/z為5 067、5 279、7 598和7 917的質(zhì)譜峰沒有改變。研究結(jié)果提示 m/z為 4 678、4 732、4 808、9 058、9 323 和9 465的蛋白質(zhì)可能參與DN的發(fā)生發(fā)展，且與achimijio-gan的治療靶點(diǎn)有關(guān)。

Sanju等［29］應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)構(gòu)建蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，以建立DN預(yù)測體系。他們用2-DE法從32例患有局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)、狼瘡腎、膜性腎病或DN的患者中分離出兩種尿蛋白。其中16例患者的尿蛋白被用來構(gòu)建這個數(shù)據(jù)庫，用另外16例患者的尿蛋白驗(yàn)證預(yù)測體系的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明此方法診斷以上疾病的敏感性在75%～86%之間，特異性在92% ～76%之間。Kasper等［30］在305個病例中，通過毛細(xì)管電泳法及電板離子化質(zhì)譜分析法，用盲法定義并證實(shí)了一組由40種生物標(biāo)志物構(gòu)成的數(shù)據(jù)，可將糖尿病患者從正常人中區(qū)分出來(敏感性89%，特異性91%)。在這些糖尿病患者中，糖尿病伴正常蛋白尿患者與DN患者有102種尿生物標(biāo)志物有顯著差異，一個包含了其中65種生物標(biāo)志物的模版可以極其靈敏地識別DN(敏感性97，特異性97%)，并將DN和其他慢性腎臟疾病區(qū)分開來(敏感性81%，特異性91%)。這個研究顯示，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)進(jìn)行尿蛋白分析可以為DN提供早期診斷。

3 展 望

DN生物標(biāo)志物研究對于早期診斷DN具有非常重要的價(jià)值，盡管目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)許多具有潛在價(jià)值的DN診斷生物標(biāo)志物，但其對DN進(jìn)展的預(yù)測價(jià)值尚未經(jīng)過循證醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。雖然蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已初步應(yīng)用于DN生物標(biāo)志物的研究，但仍存在許多技術(shù)性問題，如正常尿液蛋白含量低，對其濃縮技術(shù)還不完善;對不同疾病狀態(tài)下尿液分析還缺乏充分的標(biāo)準(zhǔn)圖譜等。隨著技術(shù)不斷改進(jìn)，相信不久的將來，人們必將發(fā)現(xiàn)更多與DN病理生理過程密切相關(guān)、并能夠準(zhǔn)確預(yù)測DN疾病進(jìn)展和嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物，從而為DN早期診斷和治療提供更多有價(jià)值的生物學(xué)信息。

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