胞內(nèi)感染病原體與細胞自噬相互作用的研究進展

王琦,蘇舒,王立新

(東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)系,江蘇南京 210009)

自噬性細胞死亡的現(xiàn)象早在20世紀60年代就已被發(fā)現(xiàn),它是指細胞內(nèi)的溶酶體降解自身細胞器和其他大分子的過程。當(dāng)細胞在缺乏營養(yǎng)或發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時,可發(fā)生細胞自噬現(xiàn)象(autophagy)。細胞開始自噬時,細胞質(zhì)中形成大量由雙層膜包裹著的待降解物質(zhì)的泡狀結(jié)構(gòu),稱自噬小體(autophagosome),隨后,自噬小體與溶酶體發(fā)生融合形成自噬溶酶體,自噬泡所包裹著的待降解物質(zhì)在溶酶體所含酶的作用下分解成氨基酸和核苷酸等,并進入三羧酸循環(huán),產(chǎn)生小分子和能量(ATP),再被細胞所利用。因此,長期以來細胞自噬被認為是細胞的自救行為,溶酶體參與其中的全過程。自噬在生理過程的作用大體可以分為3種:參與細胞的發(fā)育和分化過程;營養(yǎng)缺乏時產(chǎn)生氨基酸;清除不需要的和損傷的細胞器與分子[1]。

近來研究發(fā)現(xiàn),細胞自噬在胞內(nèi)感染性病原體的防御機制方面也發(fā)揮重要作用。一方面,胞內(nèi)感染性細菌和病毒在逃脫非吞噬細胞的內(nèi)吞體后,可被自噬體內(nèi)化、降解,從而促進細胞對胞內(nèi)感染的病原體的清除[2];另一方面,胞內(nèi)感染病原體通過某些機制逃避宿主細胞的自噬,與胞內(nèi)感染性病原體的致病機制有關(guān)[3-8]。

1 胞內(nèi)感染性細菌與細胞自噬

最近研究表明,細胞自噬是對抗胞內(nèi)細菌感染最有效的武器,通常情況下,胞內(nèi)細菌被宿主細胞內(nèi)吞后進入胞漿,宿主細胞會啟動自噬途徑,自噬小體將其包裹,并運送到溶酶體中降解。

目前認為,胞內(nèi)感染性細菌的致病機制可能與病原體入侵細胞后干擾細胞的自噬過程有關(guān):干擾自噬體與溶酶體的融合避免被降解;通過分泌某種蛋白延緩自噬體向自噬溶酶體的轉(zhuǎn)變從而停留在自噬體樣結(jié)構(gòu)的囊泡中復(fù)制;在免疫系統(tǒng)的巨噬細胞中分泌的蛋白促進自噬體樣結(jié)構(gòu)的形成;或者干擾自噬體的成熟,促進自身的存活。

結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)感染病原體,其致病機制可能與干擾自噬體與溶酶體的融合、抑制自噬途徑使得自噬體中的結(jié)核分枝桿菌不被降解等有關(guān)。Gutierrez等[3]發(fā)現(xiàn),采用饑餓或雷帕霉素(rapamycin)上調(diào)宿主細胞的自噬時,結(jié)核桿菌會被轉(zhuǎn)運到感染細胞的溶酶體中降解,雷帕霉素的藥理刺激使得吞噬小體的生成聚集從而促進自噬。同時發(fā)現(xiàn),自噬相關(guān)基因產(chǎn)物Beclin-1刺激吞噬小體的聚集,Beclin-1是hVPS34-PI3K(人類空泡蛋白34-磷脂酰肌醇3激酶)復(fù)合體上的促進自噬的亞基,含有結(jié)核分枝桿菌的吞噬體與Beclin-1相連接,促進含菌空泡體的發(fā)生自噬,從而使得結(jié)核桿菌減少。LC3(微管相關(guān)蛋白輕鏈-3)是唯一被發(fā)現(xiàn)的自噬體特征性標(biāo)記,定位在自噬體的雙層膜上。Gutierrez等[3]還發(fā)現(xiàn),加入IFN-γ不僅使巨噬細胞的LC3含量發(fā)生變化,而且結(jié)核桿菌與LC3發(fā)生共同定位現(xiàn)象,自噬的誘導(dǎo)使得胞內(nèi)生存的成熟結(jié)核桿菌減少,該共同定位現(xiàn)象能被自噬阻斷劑(3MA,wortmannin)所拮抗,提示IFN-γ抗結(jié)核菌的效應(yīng)可能與誘導(dǎo)巨噬細胞產(chǎn)生自噬有關(guān)。Jagannath等[4]也發(fā)現(xiàn),用野生型結(jié)核分支桿菌減毒菌株或卡介苗(BCG)干預(yù)的小鼠,在雷帕霉素誘導(dǎo)的自噬作用下,抗原呈遞細胞表達抗原Ag85B明顯增強,雷帕霉素還使得結(jié)核分支桿菌局限在感染細胞的自噬小體和溶酶體中。

Ogawa等[5]報道,志賀桿菌(Shigella Flexneri)通過Ⅲ型分泌系統(tǒng)(the typeⅢsecretion system,TTSS)所分泌的蛋白IcsB(志賀桿菌質(zhì)粒編碼的蛋白,定位在細菌表面)逃避宿主細胞的自噬;作者采用MDCK細胞(狗腎上皮細胞)作為志賀桿菌的感染模型,研究發(fā)現(xiàn),感染6 h后,野生型志賀桿菌的IcsB與自噬小體標(biāo)記LC3共同定位率只有10%～15%,而突變型賀桿菌的△icsB與自噬小體標(biāo)記LC3共同定位率上升至50%。在缺乏氨基酸的饑餓條件下感染1 h,野生型志賀桿菌和突變型賀桿菌(△icsB)與自噬小體標(biāo)記LC3共同定位率均有所增加(野生型志賀桿菌10%～16%;突變型賀桿菌23%～36%);而采用自噬抑制劑(如3-MA,Wortmannin)干預(yù)時,野生型志賀桿菌和突變型賀桿菌(△icsB)與自噬小體標(biāo)記LC3共同定位率均明顯減少,該現(xiàn)象提示志賀桿菌表面的IcsB蛋白與野生型志賀桿菌逃避宿主細胞的自噬作用有關(guān)。VirG蛋白(志賀桿菌Vir基因編碼,參與肌動蛋白有關(guān)的細胞內(nèi)運動)作為一種細菌靶分子,宿主細胞的自噬相關(guān)蛋白Atg-5能與VirG蛋白特異性結(jié)合,從而誘導(dǎo)細胞自噬。進一步研究顯示,IcsB并不直接抑制自噬,而是封閉或阻斷Atg-5與VirG的特異性結(jié)合,進而間接地阻斷自噬體包裹志賀桿菌,引起志賀桿菌的細胞內(nèi)感染[5]。

沙門菌(Salmonella)和軍團菌都可以利用分泌系統(tǒng)影響自噬途徑。細菌分泌的蛋白可以促進自噬體樣結(jié)構(gòu)的形成,或者干擾自噬體的成熟,促進自身的存活。沙門菌可以引起巨噬細胞的程序性細胞死亡,促進自噬體樣結(jié)構(gòu)的形成,這個過程是依賴于Ⅲ型蛋白分泌系統(tǒng)。SipB是一種具有膜融合作用的蛋白質(zhì),它通過Ⅲ型蛋白分泌系統(tǒng)被送到宿主細胞中。沙門菌表達SipB時,能形成獨特的、洋蔥樣的膜結(jié)構(gòu),該膜結(jié)構(gòu)包含了線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng),從而使細胞缺乏能量供應(yīng),細胞發(fā)生程序性死亡。而這種程序性死亡既有Ⅰ型程序性死亡的特征(如染色質(zhì)及DNA的破壞),又有Ⅱ型程序性死亡即自噬的特征(如不需要啟動凋亡基因的活化),而在沙門菌感染巨噬細胞時,SipB可以在腫脹的線粒體中發(fā)現(xiàn)。沙門菌感染的巨噬細胞可以出現(xiàn)自噬小泡的聚集,由此可以推測沙門菌通過SipB分裂線粒體引發(fā)自噬活動,從而造成巨噬細胞的死亡[6]。

而嗜肺軍團菌逃避溶酶體的融合、在胞內(nèi)的復(fù)制以及宿主細胞的溶解是依賴dot/icm基因復(fù)合體編碼出的Ⅳ型分泌系統(tǒng),空泡小體包裹嗜肺軍團菌的過程比典型的自噬體包裹過程要慢,它還通過Ⅳ型分泌系統(tǒng)釋放阻礙吞噬小泡成熟的因子,使溶酶體酶的作用延遲。自噬體和包裹嗜肺軍團菌的吞噬小泡在最后階段都需要溶酶體的特性,如LAMP-1(溶酶體聯(lián)合膜蛋白-1)、組織蛋白酶D、p H呈酸性等,但在成熟過程中,一部分的吞噬小體在特定自噬的標(biāo)志(如Atg7,LC3等)下發(fā)生聚集。對于嗜肺軍團菌感染過程的分析表明,細胞內(nèi)的分泌途徑對自噬途徑有很大影響[7]。

近來研究發(fā)現(xiàn),幽門螺旋桿菌的感染會誘發(fā)巨噬細胞產(chǎn)生自噬小體,并且在其中進行復(fù)制,部分臺灣臨床菌株可在巨噬細胞中的雙層膜結(jié)構(gòu)中進行復(fù)制,自噬小體的形成與幽門螺桿菌的復(fù)制呈相關(guān)關(guān)系。如采用雷帕霉素(自噬的誘導(dǎo)劑)上調(diào)細胞的自噬水平,幽門螺桿菌的復(fù)制亦上調(diào);而采用3-MA(3-甲基腺嘌呤,自噬的特異性的抑制劑)下調(diào)細胞的自噬,幽門螺桿菌的復(fù)制則被下調(diào)[8]。

2 病毒感染與細胞自噬

病毒與細胞自噬相互作用的結(jié)果大致分為3種:一是自噬成功的阻止了病毒的復(fù)制;二是病毒病毒阻斷了自噬,或者是誘導(dǎo)某些不完全的自噬過程,從而避免了自噬對其復(fù)制的限制;三是病毒利用自噬小體的形成促進自身的復(fù)制[9-13]。

自噬在病毒感染中起到的積極作用主要表現(xiàn)在其呈遞抗原成分,并被胞內(nèi)受體探測到,從而啟動自噬反應(yīng)。水痘-帶狀皰疹病毒(VSV)與Toll樣受體(TLR-7)的結(jié)合誘導(dǎo)了漿細胞樣樹突狀細胞(pDCS)的激活以及Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)的分泌,從而啟動了自噬反應(yīng),抑制了病毒的復(fù)制。有研究[9]表明,VZV誘導(dǎo)的自噬最終導(dǎo)致細胞質(zhì)蛋白的變性,自噬被聚丙乙酸敏感的病毒產(chǎn)物所臨時觸發(fā),在VZV感染的體外培養(yǎng)細胞自噬的降解途徑發(fā)生在較晚的時間點。檢測自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B、p62/SQSTM1以及電鏡觀察結(jié)果顯示,自噬小體在感染早期形成而在感染晚期進行降解,說明一些早期出現(xiàn)的病毒其基因產(chǎn)物的積累可能是自噬過程的主要刺激者[9]。

某些病毒感染能激活宿主細胞的自噬途徑,有研究[10]表明,一些RNA病毒感染時誘導(dǎo)形成自噬體樣結(jié)構(gòu),雙鏈RNA活化的蛋白激酶受體(PKR)激活的下游事件之一是Beclin-1依賴的自噬途徑的激活,它通過磷酸化真核細胞翻譯起始因子eIF2α啟動胞內(nèi)相應(yīng)的蛋白質(zhì)的翻譯,從而抑制或下調(diào)病毒復(fù)制,同時誘導(dǎo)自噬途徑。而 γ134.5基因編碼的產(chǎn)物ICP34.5可以通過磷酸酶使eIF2α去磷酸化而拮抗PKR的作用,從而抑制自噬,這可以成為病毒的對宿主細胞造成破壞的機制。1型單純皰疹病毒(HSV-1)的神經(jīng)毒力因子ICP34.5(由 γ134.5基因編碼)有與自噬的調(diào)節(jié)因子Beclin-1結(jié)合的結(jié)構(gòu)域,可以通過與自噬的調(diào)節(jié)因子Beclin-1的互相作用阻斷自噬過程,其具體機制現(xiàn)尚未闡明。用野生型HSV-1的感染鼠的胚胎成纖維細胞(MEFs),并沒有發(fā)現(xiàn)長壽命蛋白降解數(shù)量上的明顯增加或者是自噬體總體積的明顯增大,自噬體形成指標(biāo)未見明顯增加;而 γ134.5基因缺陷型HSV-1感染細胞,則發(fā)現(xiàn)自噬形成指標(biāo)LC3明顯增加。

電鏡觀察[11]顯示,丙型肝炎病毒(HCV)感染能誘導(dǎo)宿主細胞自噬小體空泡樣結(jié)構(gòu)的生成,HCV感染可誘導(dǎo)細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力的產(chǎn)生,使細胞在逆境下發(fā)生錯誤折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR),使許多未折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集。先前研究[11]證實,細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力可借UPR途徑誘導(dǎo)細胞自噬小體的產(chǎn)生,HCV誘導(dǎo)宿主細胞自噬小體空泡樣結(jié)構(gòu)的形成需要UPR的參與,如果利用siRNA抑制UPR途徑上重要分子的活性,將會抑制HCV誘導(dǎo)LC3的脂化,導(dǎo)致LC3-Ⅱ的下調(diào),進而阻礙自噬體的形成,從而促進病毒的復(fù)制。對HCV感染細胞的長壽蛋白降解速率以及在自噬溶酶體水平的研究表明,雖然HCV誘導(dǎo)自噬小體空泡樣結(jié)構(gòu)的生成,但不能加強自噬蛋白的降解速率,而是抑制感染細胞內(nèi)自噬體與溶酶體的融合,阻礙自噬反應(yīng)的持續(xù)進行?？傊?這些研究表明,HCV病毒能夠阻止自噬之類的細胞反應(yīng),甚至為其復(fù)制服務(wù),而自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力對病毒的復(fù)制產(chǎn)生了一定推動作用[12]。

而還有一些病毒,比如人類免疫缺陷病毒(HIV)可應(yīng)用自噬的分子機制為自身服務(wù)[13]。HIV在旁觀CD4+T細胞中誘導(dǎo)自噬依賴性的凋亡或者自噬細胞的死亡,這種情況發(fā)生在HIV-1的包裹蛋白與趨化因子受體CXCR4[趨化因子基質(zhì)細胞衍生因子-1(CXCL12)的特異受體]在CD4+細胞表面的結(jié)合。包膜蛋白介導(dǎo)的自噬需要觸發(fā)CD4+T細胞的凋亡,從而表明HIV感染誘導(dǎo)的自噬促進了旁觀CD4+T的破壞。在急性感染中,HIV感染的細胞可以通過Beclin-1和LC3-Ⅱ這些自噬標(biāo)志的下調(diào)檢測到自噬活動的下調(diào)。自噬在病毒誘導(dǎo)的細胞死亡中并不是單獨起作用,而是協(xié)助細胞凋亡作用,HIV病毒調(diào)節(jié)細胞的自噬性死亡可以看作是病毒規(guī)避免疫系統(tǒng)并且促進自身復(fù)制的一種方式。

3 問題與展望

目前分子生物學(xué)家和細胞生物學(xué)家對自噬及自噬性程序性細胞死亡的認識還處于初級階段,關(guān)于自噬現(xiàn)象的參與分子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、病理生理學(xué)意義的研究還有待進一步深入。自噬給我們提供了一個研究細胞內(nèi)生物化學(xué)機制的獨特途徑,而胞內(nèi)感染的病原體對自噬應(yīng)答的作用可以進一步幫助我們探究自噬反應(yīng)的調(diào)控,同時使我們更加明確病原體對機體的損傷機制,我們也可以合理利用自噬爭取在創(chuàng)新藥物、改進疫苗等方面有所發(fā)展。

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