人參皂苷Rb1與紅景天苷對抗皮膚光老化作用的研究

沈干,金鈺,陳德監(jiān),李昌

(南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院東院整形美容科,江蘇南京 210003)

日光是環(huán)境中促使皮膚老化的最重要因素,長期 慢性的紫外線照射可引起皮膚細胞的脂質(zhì)過氧化物增多,端粒序列縮短,使細胞壽命縮短,細胞死亡;同時長期慢性的紫外線照射還使細胞分泌金屬蛋白酶增加,分解真皮的彈力纖維和細胞間基質(zhì)量,一旦膠原降解,則皮膚菲薄,產(chǎn)生皺紋,這就是皮膚的光老化。減少自由基的產(chǎn)生和清除老化代謝產(chǎn)物,提高抗氧化酶活性已成為目前延緩皮膚衰老的有效方法。在中草藥中尋找高效、無副作用的天然自由基清除劑的研究已日益成為醫(yī)藥學和日用化學品科學一個十分活躍的研究領域。本研究就人角質(zhì)形成細胞在中波紫外線(ultraviolet B,UVB)輻照后,中藥成分人參皂苷Rb1和紅景天苷對細胞內(nèi)抗氧化酶活性及丙二醛(MDA)含量的影響進行觀察,現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

使用含10%小牛血清(杭州四季青生物公司)的RMPI-1640培養(yǎng)液(Gibco公司),在37℃、體積分數(shù)為5%CO2培養(yǎng)箱(美國Heraeus)中培養(yǎng)人角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞(由南京醫(yī)科大學駱丹教授惠贈)。傳代時以胰酶消化,以1×106ml-1的細胞濃度定量接種于96孔板中,繼續(xù)培養(yǎng),待細胞達70%融合時用于實驗。

1.2 實驗分組

本實驗分為空白對照組(0 J?cm-2UVB照射組)、60 J?cm-2UVB+人參皂苷Rb1組(人參皂苷Rb1濃度分別為0、20、50、100μg?ml-1)、60 J?cm-2UVB+紅景天苷組(紅景天苷濃度分別為0、20、50、100μg?ml-1),每組3個孔,按照不同組別接受藥物和或照光處理,照光后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3 紫外線照射

HaCaT細胞生長至70%融合時予UVB照射,照射前先棄去各孔細胞培養(yǎng)液,PBS清洗2遍后留少量PBS覆蓋細胞,與輻照燈管15 cm照射,然后棄覆蓋液,換回常規(guī)培養(yǎng)液。

應用UVB輻照度監(jiān)示器(上海Sigma公司)標定SUV-100日光紫外線模擬器(上海Sigma公司)的輻照度。UVB劑量=UVB輻照度 ×輻照時間(min)。在既往的研究基礎上,本研究選用的照射劑量是60 J?cm-2。

1.4 MTT法檢測細胞增殖活性

UVB輻照后,分別在培養(yǎng)液中加入不同濃度的人參皂苷Rb1和紅景天苷。孵育24 h后加入MTT 20μl(5 ml?ml-1),再孵育4 h后棄去上清液,加入100μl二甲亞砜(DMSO),室溫振蕩15 min。使用酶標儀于570 nm波長測定每組吸光度值,空白試劑孔調(diào)零,讀取吸光度值,觀察各組細胞的增殖活性。

1.5 中藥對抗UVB照射所致氧化損傷作用的指標檢測

以試劑盒(南京建成生物工程公司)檢測在UVB照射后加藥各組及未加藥對照組細胞的谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、氧化氫酶(CAT)活性及丙二醛(MDA)含量,以吸光度值顯示其含量。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 在UVB照射后不同濃度的人參皂苷Rb1對HaCaT細胞增殖活性的影響

HaCaT細胞經(jīng)60 J?cm-2UVB照射后,加入人參皂苷Rb1,結果顯示,細胞增殖活性漸增強(P＜0.05),并且在一定濃度范圍內(nèi)隨人參皂苷濃度增加這種細胞保護作用增強(表1)。

表1 不同濃度人參皂苷Rb1在UVB(60 J?cm-2)照射后HaCaT細胞增殖活性的變化(±s)

表1 不同濃度人參皂苷Rb1在UVB(60 J?cm-2)照射后HaCaT細胞增殖活性的變化(±s)

與空白對照組比較,a P＜0.05

人參皂苷Rb1/μg?ml-1 HaCaT細胞增殖活性0 0.264 5±0.007 20 0.581 2±0.007a 50 0.607 7±0.007a 100 0.593 6±0.007a

2.2 在UVB照射后不同濃度的紅景天苷對HaCaT細胞增殖活性的影響

HaCaT細胞經(jīng)60 J?cm-2UVB照射后,加入紅景天苷,結果顯示細胞增殖活性漸增強(P＜0.05),并且隨紅景天苷濃度增加這種細胞保護作用增強(表2)。

表2 不同濃度紅景天苷在UVB(60 J?cm-2)照射后HaCaT細胞增殖活性的變化(±s)

表2 不同濃度紅景天苷在UVB(60 J?cm-2)照射后HaCaT細胞增殖活性的變化(±s)

與空白對照組比較,a P＜0.05

紅景天苷/μg?ml-1 HaCaT細胞增殖活性0 0.378 6±0.009 20 0.601 1±0.155a 50 0.6273±0.032a 100 0.6320±0.021a

2.3 人參皂苷Rb1對UVB照射后HaCaT細胞SOD、GSH、CAT活性和MDA含量的影響

與空白對照組相比,UVB照射后細胞SOD、GSH、CAT活性明顯下降,MDA含量增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

60 J?cm-2UVB照射后,人參皂苷Rb1(20、50、100μg?ml-1)處理組與未加藥(0μg?ml-1)組相比,SOD、GSH、CAT活性明顯要高,分別高出了約3倍、2倍和2.5倍;而MDA含量在60 J?cm-2UVB照射后,人參皂苷Rb1組比未加藥組(0μg?ml-1)低,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)(表3)。

表3 不同濃度人參皂苷Rb1對UVB照射后HaCaT細胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影響(±s)

表3 不同濃度人參皂苷Rb1對UVB照射后HaCaT細胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影響(±s)

與空白對照組比較,a P＜0.05;與未加藥組比較,b P＜0.01

組 別SOD活性GSH活性MDA含量CAT活性空白對照組64.28±0.68 3.81±0.22 1.28±0.18 2.67±0.16 60 J?cm-2+人參皂苷Rb1 0μg?ml-1 13.62±2.21a 0.92±0.10a 4.30±0.18a 1.44±0.18a 20μg?ml-1 39.06±3.28b 2.04±0.55b 1.02±0.12b 2.28±0.08b 50μg?ml-1 43.35±2.09b 2.11±0.54b 1.26±0.26b 2.64±0.18b 100μg?ml-1 36.02±1.12b 1.89±0.11b 1.29±0.16b 1.86±0.09b

2.4 紅景天苷對UVB照射后HaCaT細胞SOD、GSH、CAT活性和MDA含量的影響

與空白對照組相比,UVB照射后細胞SOD、GSH、CAT活性明顯下降,MDA含量增加,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

60 J?cm-2UVB照射后,紅景天苷(20、50、100μg?ml-1)處理組與未加藥(0μg?ml-1)組相比,SOD、GSH、CAT活性明顯要高,分別高出了約3.5倍、2.5倍和1.5倍;而MDA含量在60 J?cm-2UVB照射后,紅景天苷組比未加藥組(0μg?ml-1)低,差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

表4 不同濃度紅景天苷對UVB照射后HaCaT細胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影響(±s)

表4 不同濃度紅景天苷對UVB照射后HaCaT細胞SOD、GSH、CAT活性及MDA含量的影響(±s)

與空白對照組比較,a P＜0.05;與未加藥組比較,b P＜0.01

組 別SOD活性GSH活性MDA含量CAT活性空白對照組64.28±0.68 3.81±0.22 1.28±0.18 2.67±0.16 60 J?cm-2+紅景天苷組0μg?ml-1 13.62±2.21a 0.92±0.10a 4.30±0.18a 1.44±0.18a 20μg?ml-1 45.05±0.99b 3.08±0.32b 3.04±0.30b 2.64±0.10b 50μg?ml-1 37.35±2.76b 2.72±0.07b 2.41±0.32b 2.17±0.14b 100μg?ml-1 39.76±2.29b 3.06±0.15b 2.14±0.11b 1.76±0.17b

3 討 論

皮膚是人體最大的器官,擔負著保護、感覺、調(diào)節(jié)體溫、分泌和排泄、吸收、代謝、免疫等諸多方面的功能。皮膚衰老是人體衰老的一個重要表現(xiàn)。皮膚老化分為兩種:一種是固有性老化,又稱自然老化,是由遺傳因素和不可抗力因素(如重力作用、機體內(nèi)分泌及免疫功能隨機體衰老的改變)引起的;另一種是由環(huán)境因素如紫外線、吸煙、風吹及接觸化學物質(zhì)等引起的外源性老化。而由于日光的長期反復照射是環(huán)境中影響皮膚老化的最重要因素,因此又稱光老化。自然光線中的紫外線對皮膚表皮細胞和真皮成纖維細胞的都會造成損害,其中波長在280～320 nm的紫外線(即UVA)由表皮吸收,波長在320～400 nm的紫外線(即UVB)可作用于表皮細胞和真皮的成纖維細胞[1]。

日光中的紫外線通過下列機制使皮膚損傷:(1)損傷皮膚細胞的DNA;(2)進行性蛋白質(zhì)(如膠原)的交聯(lián);(3)通過誘導抗原刺激反應的抑制途徑而降低免疫應答;(4)產(chǎn)生高度反應的自由基與各種細胞內(nèi)結構相互作用而造成細胞和組織的損傷。紫外線還可直接抑制表皮朗格罕細胞的功能,引起光免疫抑制,使皮膚的免疫監(jiān)督功能減弱而引起皮膚的光老化,并且長期光照的皮膚中微血管數(shù)量減少,使皮膚的營養(yǎng)狀況較年輕的皮膚差,更易導致皮膚的老化。

分子機制方面,長期慢性的紫外線照射可引起皮膚細胞的脂質(zhì)過氧化物增多,可使端粒序列縮短,細胞壽命縮短,使細胞死亡;同時長期慢性的紫外線照射還使細胞分泌金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)增加,分解真皮的彈力纖維和細胞間基質(zhì)量,其中MMP-1裂解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型膠原,MMP-9裂解Ⅳ、Ⅴ型膠原以及明膠,這些膠原和明膠都是維持皮膚彈性和豐滿度重要成分,膠原降解可使皮膚菲薄,產(chǎn)生皺紋[2]。

很多研究關注紫外線誘導的氧化損傷[3],紫外線照射使人角質(zhì)形成細胞HaCaT產(chǎn)生超氧陰離子,使細胞內(nèi)的H2O2大量增多,H2O2分解產(chǎn)生大量羥自由基,可引起細胞DNA斷裂[4],在角質(zhì)形成細胞凋亡中起主要作用[5]。減少自由基的產(chǎn)生和清除老化代謝產(chǎn)物,提高抗氧化酶活性已成為目前延緩皮膚衰老的有效方法。在中草藥中尋找高效無副作用的天然自由基清除劑的研究,已日益成為醫(yī)藥學和日用化學品科學一個十分活躍的研究領域。

皂苷是中草藥中一類重要的活性物質(zhì),皂苷由甾體或三萜連接糖基組成,分子中含有較多的羥基,具有較大的極性。近年研究表明,皂苷大多具有明顯的抗氧化作用,而皂苷類物質(zhì)大多能提高體內(nèi)SOD、CAT等抗氧化酶的活性,從而增強機體抗氧化系統(tǒng)的功能,防止過多的氧自由基對機體的損害。

人參皂苷Rb1為人參的主要有效成分之一,已被證明有廣泛的藥理作用,如可明顯抑制腦、心和肝臟組織中過氧化脂質(zhì)形成,具有穩(wěn)定細胞膜結構并增加其流動性,延緩神經(jīng)細胞衰老及增智作用,甚至有抗癌等作用[6-7]。

紅景天為景天科景天屬多年生草本植物,其主要藥理活性成分為紅景天苷及其苷元酪醇、酪薩維、紅景天素等。近年來研究證明,紅景天苷具有抗疲勞、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基、增強記憶、改善睡眠等多種藥理作用[8]。

在我們的實驗中,人參皂苷Rb1和紅景天苷均顯示了較強的光保護作用。我們選用人角質(zhì)形成細胞HaCaT,即UVB主要作用的皮膚細胞進行觀察,結果發(fā)現(xiàn),該細胞在UVB(60 J?cm-2)輻照后,細胞增殖率下降,氧化損傷的各指標也有顯著變化。本研究采用的60 J?cm-2UVB為適中輻照劑量,關于其他劑量UVB輻照對表皮細胞和真皮成纖維細胞的影響我們將作繼續(xù)觀察。

細胞輻照后,使用人參皂苷Rb1和紅景天苷處理使細胞增殖活性較未用藥的對照組增高(P＜0.05),細胞SOD、GSH、CAT活性較未用藥的對照組明顯升高(P＜0.01);尤其是CAT指標在人參皂苷Rb1組甚至高于無UVB照射的空白對照組;而MDA含量在UVB照射后,藥物作用組比未用藥組低(P＜0.01)。所有指標顯示,這兩種藥物成分可以對抗UVB輻照后皮膚細胞的氧化損傷,起到很好的光保護作用。

在將來的試驗中我們將采用分子生物學的手段檢測人參皂苷Rb1和紅景天苷作用后UVB照射的皮膚細胞的端粒酶活性、端粒長度、金屬蛋白酶表達等指標,為中藥在抗皮膚光老化的應用提供更科學的依據(jù)。

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