微生物抑制法檢測飼料中鹽霉素含量的研究

趙光華 陳紅歌 董小海 馬紅芳

微生物抑制法檢測飼料中鹽霉素含量的研究

趙光華 陳紅歌 董小海 馬紅芳

從幾種標準工作菌株中篩選出對鹽霉素敏感的菌株，以敏感菌株為工作菌株測定飼料中鹽霉素的含量。結果顯示：枯草芽孢桿菌、藤黃微球菌對鹽霉素不敏感，地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌對鹽霉素敏感。以嗜熱脂肪芽孢桿菌敏感菌株為工作菌株測定飼料中鹽霉素含量，最低檢出濃度為0.25μg/m l，飼料中最低檢出限為1.0mg/kg，標準曲線相關系數(shù)為0.99，回收率在60%～80%，均高于標準中規(guī)定的參數(shù)。試驗結果表明：微生物抑制法檢測飼料中鹽霉素含量，靈敏度高，快速，簡便。

鹽霉素；微生物抑制法；枯草芽孢桿菌；地衣芽孢桿菌；藤黃微球菌；嗜熱脂肪芽孢桿菌

鹽霉素（Salinomycin Sodium）[1,2]是由白色鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的一種一元羧酸聚醚類抗生素，具有特有的環(huán)狀結構，是典型的離子載體抗生素，屬于離子載體抗球蟲藥，通常為鈉鹽。由于其廣譜高效、不易產(chǎn)生耐藥性，國內外廣泛用來防治牛、羊、雞、兔的球蟲病，同時可以作飼料添加劑使用，促進畜禽生長發(fā)育和提高飼料利用率[3]。鹽霉素對人無害，不干擾植物生長，不影響土壤中的微生物。但聚醚類抗生素使用劑量安全范圍較窄，在飼料中含量稍大即可使動物的增重減慢，飼料轉化率降低，并且隨著人們對動物性食品質量要求的提高以及對外出口貿(mào)易的需要，飼料中鹽霉素含量的準確測定則顯得尤為重要。

本試驗就是采用微生物抑制法的原理對飼料中鹽霉素含量的測定方法作了進一步的研究。確定了地衣芽孢桿菌也可以作為工作菌株使用，確定了最適菌層濃度，并優(yōu)化了樣品前處理程序和菌種培養(yǎng)程序。微生物抑制法[4]與高效液相色譜法[5]、分光光度法[6]、質譜聯(lián)用法[2]等儀器法相比較，儀器法前處理復雜，試劑損耗大，儀器昂貴，而微生物抑制法則有良好的劑量關系，較低的檢出限，可接受的回收率，并且前處理簡單、不需要昂貴的儀器設備，能同時篩選大量樣品，具有方便、快速的優(yōu)點。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 標準品

鹽霉素鈉，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司生產(chǎn)，含量80.0%。用無水甲醇稀釋成濃度為1000μg/m l的標準儲備液，置于0～5℃冰箱保存，臨用時用甲醇溶液（9+1）將標準儲備液分別稀釋成不同濃度。

1.1.2 標準菌株

嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus var.calidolactis，CMCC63509，廣東省微生物研究所菌種保藏中心提供）；藤黃微球菌（CMCC28001，廣東省微生物研究所菌種保藏中心提供）；枯草芽孢桿菌(單位自有)；地衣芽孢桿菌（單位自有）。

1.1.3 試劑

無水甲醇（分析純）；中性氧化鋁：270～335目，300℃活化3 h備用；抗生素檢定Ⅰ、Ⅱ號培養(yǎng)基。

1.1.4 儀器與設備

高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱、旋轉真空蒸發(fā)器、離心機、振蕩器、游標卡尺、牛津杯、培養(yǎng)皿（具陶瓦蓋）、可調微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 檢測條件的優(yōu)化

1.2.1.1 對鹽霉素敏感菌株的篩選

分別取嗜熱脂肪芽孢桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌斜面菌種接種于營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后用5ml滅菌水洗下菌苔，作為菌液儲備液。在Ⅱ號培養(yǎng)基中分別加入上述4種菌液儲備液，制成檢定平板，每個平板等距離放置3個牛津杯，牛津杯中加入100μl參照濃度為1μg/m l的鹽霉素標準品稀釋液，分別于55℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后測量每個平板的抑菌圈直徑，選擇有抑菌圈，且抑菌圈邊緣光滑、完整的敏感菌株。

1.2.1.2 最適菌層濃度的選擇

在Ⅱ號培養(yǎng)基中分別加入0.01%、0.025%、0.05%、0.075%、0.10%濃度的敏感菌株的菌液儲備液，菌液儲備液以營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)24 h后用10ml滅菌生理鹽水洗下，即為菌液儲備液。以此不同濃度菌液作為平板菌層添加液，制成一系列菌層濃度的平板，每個平板等距離放置6個牛津杯，3個牛津杯中分別加入100μl參照濃度1μg/ml的鹽霉素標準品稀釋液，另3個牛津杯中分別加入100μl參照濃度5μg/ml的鹽霉素標準品稀釋液，55℃培養(yǎng)（17±1）h后測量每個平板的抑菌圈直徑，選擇最適菌層濃度，使得參照濃度的抑菌圈直徑大于10mm，并且抑菌圈邊緣光滑、完整。

1.2.1.3 飼料中最低檢測限的測定

在空白飼料樣品中加入已知量的不同濃度的標準品，準確加入20.0ml樣品提取液，震蕩1 h后靜置片刻，全部轉移到準備好的氧化鋁柱中，用樣品提取液不間斷洗脫，用100ml容量瓶接收至刻度。稀釋或濃縮后為試驗樣液，經(jīng)培養(yǎng)、測定抑菌圈直徑，以產(chǎn)生直徑大于10mm的明顯、清晰抑菌圈的最小濃度為最低檢測限。

1.2.1.4 飼料中回收率的測定

分別取不同濃度的鹽霉素標準溶液各1.0ml添加到空白飼料樣品中，同1.2.1.3節(jié)處理樣品，培養(yǎng)、測定抑菌圈直徑，代入標準曲線回歸方程，計算樣品藥物濃度和回收率。

1.2.2 標準曲線的建立

以最適菌層濃度為菌液添加濃度，用甲醇溶液稀釋鹽霉素標準儲備液，分別配制成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/ml和 5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μg/m l各五個工作濃度的兩條標準曲線，前者以1.0μg/ml為標準參考濃度，后者以5.0μg/ml為標準參考濃度，培養(yǎng)，測定抑菌圈直徑，校正后繪制標準曲線圖或計算回歸方程。

2 結果與分析

2.1 對鹽霉素敏感菌株的篩選

分別取嗜熱脂肪芽孢桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的菌液儲備液，分別以0.10%濃度的菌層濃度接種于Ⅱ號培養(yǎng)基中，制成檢定平板，以1μg/ml的鹽霉素標準品稀釋液為參照濃度，分別于55℃培養(yǎng)16 h后測量每個平板的抑菌圈直徑，結果見表1。

表1 敏感菌株的篩選（n＝6）

結果表明：除枯草芽孢桿菌外，其他幾種標準菌株均對鹽霉素敏感，其中在相同的菌層濃度、相同的參照濃度的情況下，嗜熱脂肪芽孢桿菌的抑菌圈直徑最大，說明嗜熱脂肪芽孢桿菌對鹽霉素最為敏感，地衣芽孢桿菌次之，藤黃微球菌更次之，枯草芽孢桿菌不敏感。地衣芽孢桿菌的抑菌圈直徑也大于10mm，且邊緣清晰完整，也可以作為工作菌株使用。

2.2 最適菌層濃度的選擇

依據(jù)2.1節(jié)得出的結論，選擇嗜熱脂肪芽孢桿菌標準菌株為工作菌株，在Ⅱ號培養(yǎng)基中分別加入0.01%、0.025%、0.05%、0.075%、0.10%濃度的敏感菌株的菌液儲備液，每個菌層濃度分別以5μg/ml和1μg/ml的鹽霉素標準稀釋液為參照濃度，55℃培養(yǎng)16 h后測量每個平板的抑菌圈直徑，結果見表2。

表2 菌層濃度對抑菌圈直徑的影響（n＝6）

由表2可以看出，隨著菌層濃度的增加，檢定平板中菌落生長由稀疏到稠密，抑菌圈邊緣由不清晰到清晰，再到出現(xiàn)雙圈現(xiàn)象，菌層濃度的高低直接影響著抑菌圈的直徑和質量。在0.05%菌液添加量時，5μg/ml和1μg/ml的鹽霉素參照濃度的抑菌圈的直徑均出現(xiàn)最大值，在大于0.05%菌液添加量時，5μg/ml和1μg/ml的鹽霉素參照濃度的抑菌圈直徑均出現(xiàn)減小的趨勢，因此得出，0.05%菌液添加量為最適菌層濃度。

2.3 標準曲線的線性分析

以0.05%菌液添加量為最適菌層濃度，用甲醇溶液稀釋鹽霉素標準儲備液，分別配制成0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg/m l和 5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μg/ml各五個工作濃度的兩條標準曲線，前者以1.0μg/ml為標準參考濃度，后者以5.0μg/ml為標準參考濃度，培養(yǎng)，測定抑菌圈直徑。結果見表3、表4。

表3 標準曲線1：各點平均抑菌圈直徑的校正值

表4 標準曲線2：各點平均抑菌圈直徑的校正值

由表3、表4可以看出，0.25μg/ml濃度的標準溶液產(chǎn)生的抑菌圈直徑小于10mm，0.5μg/ml濃度的標準溶液產(chǎn)生的抑菌圈直徑大于10mm，且邊緣清晰完整，可以得出方法的靈敏度為0.5μg/ml。對兩組標準曲線的回歸方程進行計算，得出相關系數(shù)在0.9809～0.9985，斜率的變異系數(shù)（CV）為 10.6%～15%，符合我國關于殘留檢測方法對于回收率和變異系數(shù)的規(guī)定。

2.4 飼料中回收率和最低檢出限的測定

2.4.1 回收率的測定

測定鹽霉素添加水平為 0.5、1.0、10.0、100.0 μg/g的飼料中的回收率，試驗結果見表5。

表5 飼料中的回收率

從表5可以得出：幾個鹽霉素添加水平，其回收率均在60%～80%，變異系數(shù)在10%左右，可以滿足殘留檢測方面的要求。

2.4.2 最低檢出限的測定

從表5可以看出，飼料中各添加水平的回收率均在60%～80%，但添加水平為0.5μg/g時，無抑菌圈，檢測不出。1.0μg/g添加水平的抑菌圈邊緣清晰，直徑大于10mm，故在飼料中鹽霉素的最低檢出限為1.0μg/g。

3 討論

3.1 微生物抑制法檢測影響因素分析

微生物抑制法檢測獸藥殘留具有很大的生物學優(yōu)勢，但也因其生物學特性差異而影響因素較多，并且非常復雜，最適菌層濃度、最佳菌含量、最佳培養(yǎng)條件、加液準確性等因素直接影響著檢測結果的準確性。特別是在標準曲線的制備上，相關系數(shù)較低，差異較大，如何減少上述因素造成的平板間的差異是實現(xiàn)檢測方法準確度和重現(xiàn)性的關鍵。

3.2 最低檢出限和回收率的優(yōu)缺點

試驗中通過降低標準曲線濃度，使得方法的檢出限進一步降低，達到1.0μg/g，比國標方法低0.25μg/g，實現(xiàn)了檢測方法的進一步優(yōu)化。該檢測方法的回收率在60%～80%，屬于較低水平，但生物學檢測的不確定因素較多，成分損失較多，因其具有良好的快速篩選性，只要精密度符合要求，低回收率可以接受。

3.3 微生物抑制法在獸藥殘留檢測方面的擴展性以及快速檢測試劑的開發(fā)

微生物抑制法因其具有很大的廣泛性和快速的篩選性在獸藥殘留檢測方面具有很好的擴展性。只要某一種或幾種抗生素對某種微生物有抑制作用，反過來就可以利用該微生物對上述抗生素進行檢測。如果把相關的敏感微生物連同培養(yǎng)、顯色等試劑一起固化，簡化微生物菌株和試劑的保藏條件，延長微生物菌株和試劑的使用期限，減少試驗操作步驟，結合簡單的判讀儀器，可以實現(xiàn)檢測方法的快速化和商品化。

[1]徐奇友,許紅.鹽霉素及其在飼料中的應用[J].飼料博覽,2002(6)：31-32.

[2]Mortier L,Daeseleire E,Van Peteghem C.Determination of the ionophric coccidiostats narasin,monensin,lasalocid and salinomycin in eggs by lipuid chromatography mass spectrometry[J].Rapid Commun Mass Spectrom,2005,19(4)：533-539.

[3]戚風娥.鹽霉素的應用與生產(chǎn)研究[J].今日養(yǎng)豬業(yè),2005(5)：45-46.

[4]李娜,孫浩,祁克宗.肌肉組織中鹽霉素殘留的微生物法檢測研究[J].飼料工業(yè),2008,29(3)：45-48.

[5]馬立農(nóng),陳杖榴.高效液相色譜柱前衍生化法測定飼料中的鹽霉素[J].中國獸醫(yī)雜志,2002,36(2)：33-35.

[6]宋榮,常碧影.飼料中鹽霉素的測定方法[J].中國飼料，2003(8)：25-26.

（編輯：張學智，mengzai007@163.com）

S816.17

A

1001-991X（2010）13-0045-03

趙光華，河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，河南省農(nóng)科院質標中心，450002，河南省鄭州市農(nóng)業(yè)路1號。

陳紅歌，河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院。

董小海、馬紅芳，河南省農(nóng)科院質標中心。

2010-03-14