乳酸在控制豬感染沙門氏菌中的研究

劉國祥 王文慶 申介健 趙 港

乳酸在控制豬感染沙門氏菌中的研究

劉國祥 王文慶 申介健 趙 港

耐藥性沙門氏菌越來越普遍，因此，有必要尋找替代方法來控制豬沙門氏菌感染。試驗初步研究了乳酸在控制豬沙門氏菌感染的效果。在實驗中每頭豬接種5 ml 5.6×107CFU/ml(hi)或5 ml 5.6×105CFU/ml(lo)鼠傷寒沙門氏菌(ST)，重現(xiàn)豬臨床和亞臨床感染。分別喂食加入2.8%乳酸（LA）和不加乳酸（C）的飼料，以觀察喂食乳酸的效果。將20只22日齡的豬分成4組，分別為LA-hiST、C-hiST、LA-loST和C-loST，相應(yīng)的組別喂食相應(yīng)的飼料。接種ST116后，觀察豬的臨床癥狀和檢測其糞便中ST116的數(shù)量。LA-hiST組沒有明顯的臨床癥狀，比如腹瀉和發(fā)熱等癥狀，但是C-hiST組有明顯的臨床癥狀，并且豬糞便中沙門氏菌數(shù)LA-hiST組低于C-hiST組，LA-loST組低于C-loST組。實驗數(shù)據(jù)表明，飼料中加入2.8%的乳酸能有效的控制沙門氏菌臨床和亞臨床感染。

耐藥性；乳酸；沙門氏菌。

沙門氏菌是一種致病菌，但是在日常生活中，人和動物感染沙門氏菌是非常普遍的。為了降低人類因食入性感染沙門氏菌的風(fēng)險，從養(yǎng)豬場到屠宰場，都應(yīng)該采取一些措施，以控制沙門氏菌的感染。

通常用抗生素控制豬感染沙門氏菌，但是，人和動物經(jīng)常使用抗生素，耐藥的細(xì)菌就會出現(xiàn)[1]。大量的數(shù)據(jù)顯示，耐藥的沙門氏菌來源于人和動物[2,7]。研究人員正在探索控制豬沙門氏菌感染的方法[2]。

繼歐盟禁止在食品和飼料中使用大多數(shù)抗生素后，出現(xiàn)了一些替代措施，以控制腸道內(nèi)有害的細(xì)菌數(shù)量和活性。這些措施包括更嚴(yán)格的管理和使用衛(wèi)生的產(chǎn)品，比如益生菌、益生素、蛋白酶、中草藥、植物提取物、發(fā)酵飼料和有機酸等。

乳酸是有機酸，現(xiàn)實中已經(jīng)被證實，在飼料中添加2.8%乳酸，大大降低了豬糞便中沙門氏菌的數(shù)量，從而降低沙門氏菌在豬群中大范圍感染的幾率。如在日本的一個養(yǎng)豬場，沙門氏菌感染導(dǎo)致豬群出現(xiàn)臨床和亞臨床癥狀[3,4]，在喂食添加乳酸的飼料后，沙門氏菌感染得到有效控制。但在實驗中，乳酸還沒被證實能有效控制沙門氏菌感染。

本論文的目的是評估豬在攝入2.8%乳酸的情況下，控制豬感染沙門氏菌的臨床效果，以及在因感染沙門氏菌而有臨床和亞臨床癥狀的豬中，降低豬糞便中沙門氏菌數(shù)量的效果。豬糞便中沙門氏菌的數(shù)量是沙門氏菌能否在豬群中流行的一個重要指標(biāo)。

1 實驗材料和方法

1.1 實驗材料

實驗用的豬由鄲城宏盛養(yǎng)豬場提供，乳酸由河南金丹乳酸科技有限公司提供，對利福平抗生素有耐藥性的鼠傷寒沙門氏菌116菌株（簡稱為ST116）由鄭州大學(xué)生物系提供，其它實驗儀器及材料由河南金丹乳酸科技有限公司技術(shù)部和檢測中心提供。

1.2 實驗方案

確認(rèn)實驗組中每頭豬都沒感染ST，然后將20只21日齡的豬按性別、體重等條件均衡分成4組，依次為LA-hiST、C-hiST、LA-loST和C-loST，并分別圈養(yǎng)于獨立的圈舍內(nèi)。LA-hiST和LA-loST組喂食加入2.8%金丹牌乳酸的飼料，C-hiST和C-loST組喂食不加乳酸的飼料，直到實驗結(jié)束。到31日齡大時，LA-hiST和 C-hiST 組接種 5m l 5.6×107CFU/ml的ST116，LA-loST和 C-loST組接種 5 ml 5.6×105CFU/ml的ST116。接種前5 h和接種后1 h內(nèi)禁止喂食。在接種后第21 d，將實驗組豬注射戊巴比妥鈉（25mg/kg），使其深度麻醉，然后放血致死。除了接種前后禁食6 h，實驗期間的其它時間，實驗組豬可以任意攝取飼料和水。

1.3 菌株和接種

ST116最初是從豬身上分離出來的，在實驗室中，此菌株能在含有利福平濃度為100μg/ml的DHL培養(yǎng)基上生長。使用前，此菌株保存于-80℃度冰箱中。將此菌株的一個菌落接種于SCD肉湯培液中，于37℃，180 r/min培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 h。然后取20ml接種到180ml SCD肉湯培養(yǎng)液中，于37℃，180 r/min培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h。將此培養(yǎng)液用無菌PBS緩沖液稀釋成菌體濃度為107和105CFU/ml，然后分別加入等體積的20%脫脂牛奶。用注射器和塑料管經(jīng)咽部給予相應(yīng)組別的豬接種相應(yīng)的10ml上述菌液。因為含有20%的脫脂奶粉，所以豬會自愿吞咽的。

1.4 臨床觀察

在接種 ST116 后的第 1、2、3、6、7、9、12、16 和 21 d，收集每組豬的糞便，并且將糞便分成三個等級，0表示糞便正常，1表示糞便稀松，2表示腹瀉。從接種ST116前第7 d開始測量豬的直腸溫度，直到實驗結(jié)束。

1.5 細(xì)菌學(xué)檢驗

從每組實驗豬中收集糞便樣品，每克糞便樣品用無菌PBS緩沖液稀釋成不同的濃度，涂布于顯色平板上。將平板置于37℃下孵育24 h，直接計算瓊脂平板上的菌落數(shù)。然后開始富集和隨后的二次富集程序，簡單的來說就是：將1 g豬糞便樣品溶于10ml無菌PBS緩沖液中，取此溶液1ml溶于9ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,于41.5℃下培養(yǎng)24 h，或者于室溫下放置7 d進(jìn)行二次富集，分別在顯色瓊脂平板上劃線培養(yǎng)。富集培養(yǎng)中，一旦出現(xiàn)陽性結(jié)果，立即終止富集培養(yǎng)程序。尸體解剖中，無菌條件下收集小腸和盲腸內(nèi)含物，做上述培養(yǎng)，以確定有無ST116及其數(shù)量。并且，在無菌條件下收集肝、肺脾、腎、扁桃體和腸系膜淋巴結(jié)等組織，做上述培養(yǎng)，以確定有無ST116及其數(shù)量。

1.6 統(tǒng)計

正態(tài)分布變量，如直腸溫度和ST116數(shù)量，進(jìn)行T檢驗；非正態(tài)變量，如糞便評分條件，進(jìn)行U檢驗。ST116數(shù)量以對數(shù)表示，0代表每克豬糞便中有一個ST116。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種ST116后的臨床癥狀

接種ST116后，整個實驗期間，LA-hiST組既未糞便稀松也沒腹瀉。而在C-hiST組中，80%的豬在接種后的第3、6、7 d出現(xiàn)糞便稀松或腹瀉，糞便平均得分分別為 0.8、1.6 和 0.8（見表 1）。LA-loST 組第 3～9 d出現(xiàn)零星稀松糞便和腹瀉，C-loST組在第7～9 d出現(xiàn)零星稀松糞便和腹瀉，LA-loST和C-loST組糞便最高平均得分分別為0.4和0.6。

表1 接種后各實驗組糞便的平均得分

2.2 發(fā)熱反應(yīng)

在接種ST116前第7 d開始測量記錄每頭豬的體溫。在飼料中加入2.8%乳酸的（LA-hiST和LA-loST）組，在接種ST116后未觀察到有發(fā)熱反應(yīng)（見圖1）；在飼料中未加入乳酸的C-hiST組，在接種ST116后的第2～9 d有發(fā)熱反應(yīng)；C-loST在接種ST116后的第5～8 d有發(fā)熱反應(yīng)。

2.3 糞便中ST116的數(shù)量

取接種ST116后第3、12、16 d的糞便做實驗，發(fā)現(xiàn)每克糞便中ST116的數(shù)量，LA-hiST組要明顯少于C-hiST 組（P＜0.05）（見圖 2A）；取接種 ST116后第 6、7、9、12 d的糞便做實驗，發(fā)現(xiàn)每克糞便中ST116的數(shù)量，LA-loST組要明顯少于C-loST組（P＜0.05）（見圖2B）。通過實驗得到LA-hiST、C-hiST、LA-loST和C-loST組中ST116的峰值數(shù)量分別是3.2×101CFU/g、1.3×105CFU/g、2.5 CFU/g和 1.3×104CFU/g。

2.4 各器官和腸道內(nèi)含物的ST116數(shù)量情況（見表2）

從尸體回收的肝臟、扁桃體、腸系膜淋巴結(jié)等組織以及小腸和盲腸內(nèi)容物，在無菌條件下恢復(fù)培養(yǎng)ST116。LA-hiST、C-hiST、LA-loST 和 C-loST 組小腸中取出的內(nèi)容物，能培養(yǎng)出ST116的幾率分別是20%、80%、40%和 80%；LA-hiST、C-hiST、LA-loST和C-loST組盲腸中取出的內(nèi)容物，能培養(yǎng)出ST116的幾率分別是80%、100%、40%和80%。從對比結(jié)果中可以看出，在飼料中添加乳酸的實驗組要比沒有添加乳酸的實驗組，培養(yǎng)出ST116的幾率低。并且，在飼料中添加乳酸的實驗組要比沒有添加乳酸的實驗組，含有ST116的數(shù)量低。從結(jié)果中可以看出，LA-hiST和C-hiST具有統(tǒng)計學(xué)上的差異性（P＜0.05）。

表2 每頭豬各器官及小腸和盲腸內(nèi)容物的含菌量

3 討論

在我們的實驗中，飼料中添加2.8%的乳酸，可以消除由于接種ST116所引起的臨床癥狀，如腹瀉和發(fā)熱，并且能降低糞便中ST116的數(shù)量。

接種5 ml 5.6×107CFU/ml ST116后，飼料中未添加乳酸的實驗組，都出現(xiàn)了腹瀉和發(fā)熱癥狀，而添加乳酸的實驗組，未出現(xiàn)腹瀉和發(fā)熱癥狀。因此，在飼料中添加2.8%的乳酸能消除由于接種ST116所引起的臨床癥狀。

在飼料中添加2.8%的乳酸，能降低實驗組糞便中ST116的數(shù)量，這意味著乳酸能降低豬腸道中ST116的數(shù)量。這一結(jié)果解釋了為什么乳酸能消除豬因接種ST116所引起的臨床癥狀。在我們的實驗中，盲腸中ST116的數(shù)量，LA-hiST組明顯少于C-hiST組。Jorgensen等人[5]報道稱，乳酸能降低沙門氏菌在養(yǎng)豬場的流行。本實驗驗證了乳酸能降低養(yǎng)豬場內(nèi)沙門氏菌的數(shù)量，從而降低了沙門氏菌在養(yǎng)豬場的流行。

在比較低的pH值條件下，乳酸被認(rèn)為具有殺菌作用。Jung等[6]報道稱，豬的胃內(nèi)pH值是3.82～4.07。在pH值為3.7時，乳酸作用3 h能將ST的數(shù)量降低100倍；在pH值為4.0時，乳酸作用3 h能將ST的數(shù)量降低10倍；在pH值為4.4時，乳酸對鼠傷寒沙門氏菌沒有作用。因此，推測乳酸在豬胃里才具有殺菌作用。

在本實驗中，接種ST116前，LA-hiST和 LA-loST實驗組已經(jīng)開始攝食加入乳酸的飼料，因此，這有可能引起腸道內(nèi)短鏈脂肪酸的增多，從而改變腸道脂肪的組成，另外，腸道內(nèi)原有的微生物群也有可能會被改變。Casey等人[5]報道稱，乳酸在動物體內(nèi)會被迅速的代謝成乙酸、丙酸和丁酸，這種變化會對ST有所影響。Van Immerseel等人[7]報道稱，有機酸能干擾沙門氏菌基因表達(dá)，并且，乳酸能降低沙門氏菌在雞腸道內(nèi)定居的幾率。具體的機制目前還不清楚，有待于進(jìn)一步研究。

在以前的研究中，接種沙門氏菌后，糞便中沙門氏菌的含量會很快達(dá)到峰值[6]。但在本實驗中，C-loST和C-hiST組接種鼠傷寒沙門氏菌后，其糞便中ST116的含量達(dá)到峰值的時間分別是接種后的第9 d和第12 d，此種現(xiàn)象的一個解釋是應(yīng)激反應(yīng)[8]。但是，在本實驗中，給予實驗組豬的生活環(huán)境和喂食條件并沒有變化，因此，我們可以排除應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致豬糞便中ST116的含量峰值推遲的解釋。C-loST組糞便中ST116的含量峰值出現(xiàn)在接種后的第9 d，豬體溫的最高值出現(xiàn)在接種ST116后的第6 d，這表明在豬的腸道和身體其它部位，ST116的含量最大值出現(xiàn)在接種后的第6～9 d；C-hiST組糞便中ST116的含量峰值出現(xiàn)在接種ST116后的第3 d，豬體溫的最高值出現(xiàn)在接種ST116后的第3 d，這表明在豬的腸道和身體其它部位，ST116的含量最大值出現(xiàn)在接種后的第2～3 d。C-hiST組糞便中ST116的含量峰值出現(xiàn)在接種后的第12 d，但是此時豬的體溫并未上升，此種現(xiàn)象可能是因為在接種后的第12 d，ST116僅僅只在豬腸道內(nèi)含量達(dá)到峰值，本實驗還不能闡明這種現(xiàn)象的具體原因。

在本實驗中，糞便中ST116的數(shù)量與接種劑量有關(guān)。接種5 ml 5.6×107CFU/ml的ST116后，飼料中未加乳酸的實驗組都能分離出ST116，而飼料中加入乳酸的實驗組，其中40%不能分離出ST116。因此，在飼料中添加2.8%的乳酸，能有效控制沙門氏菌在養(yǎng)豬場的傳染。

[1]Aarestrup FM,et al.Association between the consumption of antimicrobial agents in animal husbandry and the occurrence of resistant bacteria among food animals[J].Int.J.Antimicrob.Agents,1999，12：279-285.

[2]Casey P G,et al.A five-strainprobiotic combination reduces pathogen shedding and alleviates disease signs in pigs challenged with Salmonella enterica serovar Typhimurium[J].Appl.Environ.Microbiol,2007,73：1858-1863.

[3]Asai T,et al.Isolation of Salmonella from diarrheic feces of pigs[J].J.Vet.Med.Sci,2002,64：159-160.

[4]Kishima M,et al.Nationwide surveillance of Salmonella in the faeces of pigs in Japan[J].Zoonoses Public Health,2008,55：139-144.

[5]J?rgensen L.Weaner feed that reduces Salmonella：the effects of the form of the feed and of addition of lactic acid on the prevalence of Salmonella,Lawsonia,gastro-intestinal health,and productivity[J].Danish Pig Production Report,2002,543.

[6]Jung Y S,et al.Sensitivity of multidrug-resistant Salmonella Typhimurium DT104 to organic acids and thermal inactivation in liquid egg products[J].Food Microbiol,2000,17：63-71.

[7]Van I F,et al.The use of organic acids to combat Salmonella in poultry：a mechanism of explanation of the efficacy[J].Avian Pathol,2006,35：182-188.

[8]Callaway T R,et al.Social stress increases fecal shedding of Salmonella Typhimurium by early wenaed piglets[J].Curr.Issues Intest.Microbiol,2006（70）：65-72.

（編輯：劉敏躍，lm-y@tom.com）

S816.75

A

1001-991X（2010）15-0057-04

劉國祥，河南金丹乳酸科技有限公司，工程師，477150，河南省鄲城縣金丹大道08號。

王文慶、申介健、趙港，單位及通訊地址同第一作者。

2010-04-14