豬血漿蛋白粉中IgG含量的酶聯(lián)免疫檢測方法研究

劉中勇 馬孝斌 高東微 劉 津 王雅靜

血漿蛋白粉(Spray-dried Plasma Protein,SDPP)是利用現(xiàn)代生物技術(shù)和加工手段，對新鮮血液進(jìn)行抗凝處理和分離，將血漿從血液中分離出來，再進(jìn)行壓縮和低溫保存，然后采取特殊的工藝進(jìn)行噴霧干燥，最后制成乳白色或淺褐色的粉末狀產(chǎn)品[1-2]。由于血漿蛋白粉含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，其作為一種新型、高效、安全的功能性蛋白質(zhì)飼料，在斷奶仔豬飼養(yǎng)中已經(jīng)成為必不可少的蛋白飼料。

血漿蛋白粉目前還無統(tǒng)一質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，但已形成業(yè)內(nèi)認(rèn)可的檢測指標(biāo)，如感官檢測、顯微鏡分析、水溶性檢測、常規(guī)指標(biāo)檢測、凝膠實驗及免疫球蛋白IgG定量檢測[3]。其中IgG的檢測基層使用的主要是免疫單擴散法，該方法耗時長，一般需要1～2 d才能出結(jié)果，重復(fù)性也差[3]。而作為國家標(biāo)準(zhǔn)的液相色譜方法由于儀器及檢測成本較高，在基層難以推廣[4]。因此目前亟需一種快速檢測方法解決這個問題。本研究通過制備豬IgG單克隆抗體，進(jìn)行調(diào)試優(yōu)化，建立了基于間接競爭酶聯(lián)免疫原理的快速檢測方法。

1 實驗材料與方法

1.1 試劑

豬IgG、牛IgG、豬乳鐵蛋白等參考標(biāo)準(zhǔn)品，弗氏完全和不完全佐劑、細(xì)胞培養(yǎng)液等均購自美國Sigma公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗為博奧森生物公司產(chǎn)品；四甲基聯(lián)苯胺購自欣經(jīng)科生物科技公司；其他常用有機試劑、無機試劑均為分析純，由北京化學(xué)試劑公司提供。

1.2 材料和儀器

酶標(biāo)板條、細(xì)胞培養(yǎng)板等（華美生物工程公司），MK3酶標(biāo)儀（熱電公司），振蕩器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司），細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋），電子天平（德國賽多利斯），其余為實驗室常規(guī)儀器。

1.3 實驗動物及細(xì)胞株

Balb/c小鼠由中國科學(xué)院遺傳研究所提供，SP2/0細(xì)胞株由北京望爾生物技術(shù)有限公司保存。

1.4 方法

1.4.1 抗豬IgG單克隆抗體的制備

將豬IgG標(biāo)準(zhǔn)品用pH值7.2 PBS溶解為1 mg/ml后，按照每只Balb/c小鼠100 μg的劑量與等量的弗氏佐劑混合后皮下多點免疫。初次免疫時佐劑為完全佐劑，其余為不完全佐劑。多次免疫后眼眶采血測定血清效價。以150 μg劑量加強免疫后取小鼠脾細(xì)胞按照常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞融合，篩選強陽性細(xì)胞株后以體內(nèi)誘生法制備腹水，經(jīng)飽和硫酸銨法純化后，測定其靈敏度，篩選適合于本研究的目標(biāo)抗體及細(xì)胞株。

1.4.2 酶標(biāo)板的制備及抗原抗體工作濃度的選擇

將豬IgG用PBS配制為1 mg/ml的儲存液后，以PBS 按 照 1： 10、1： 50、1： 100、1： 500、1： 1000、1： 3000稀釋后，每孔加入100 μl，室溫靜置2 h后，4℃過夜后甩掉孔內(nèi)液體，再加入封閉液（0.05 mol/l pH值 9.5的碳酸鹽緩沖液，每孔 100 μl），室溫孵育2 h，PBST洗板3次，加入梯度稀釋的單克隆抗體后，按照常規(guī)ELISA反應(yīng)操作，測定吸光度值，確定最優(yōu)化的抗原抗體反應(yīng)比例。

1.4.3 ELISA檢測程序

按照間接競爭酶聯(lián)免疫法的原理[5]，以一步法進(jìn)行ELISA反應(yīng)，具體如下：將豬IgG標(biāo)準(zhǔn)品儲備液稀釋成 0、0.2、0.6、1.8、5.4、16.2 μg/ml后，以 50 μl每孔加入酶標(biāo)板，然后加入50 μl以優(yōu)化濃度比例稀釋得到的單克隆抗體溶液，再加入3000倍稀釋的羊抗鼠酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30 min。以PBS-T洗板3次。每孔加入100 μl顯色底物液（TMB-過氧化氫溶液），37℃顯色反應(yīng)15 min，最后加入1 mol/l硫酸50 μl終止反應(yīng)。在酶標(biāo)儀上以450 nm讀取各孔吸光度。

1.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及結(jié)果計算

對標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)3次ELISA測定，記錄OD值。根據(jù)楊利國等所述的logit-log作圖法，以logity=ln其中 B為0 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值，B為其0它標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值)計算值作為y軸，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度對數(shù)(logC)作為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[5]。

1.4.5 方法性能評價

血漿蛋白粉等具有較好的水溶性，因此直接用緩沖液如PBS等進(jìn)行溶解后配制成一定濃度就可以進(jìn)行ELISA測定。本研究即以此進(jìn)行樣品處理，分別就方法的特異性、最低檢測限、回收實驗及精密度等指標(biāo)進(jìn)行評價。

2 結(jié)果

2.1 抗體的制備及篩選

測定免疫血清后，選擇效價較高的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合，得到了13株陽性細(xì)胞株，各細(xì)胞株所分泌抗體的靈敏度分別為0.1～0.5 μg/ml不等，為了使最終所建立的方法檢測樣品稀釋度較低，準(zhǔn)確率較高，特選擇了靈敏度為0.3 μg/ml的抗體作為后續(xù)實驗對象。

2.2 抗原抗體最佳工作濃度

根據(jù)前期設(shè)定的實驗方案進(jìn)行ELISA測定，結(jié)果如表1所示。

表1 抗原抗體最佳工作濃度

由表1可知，當(dāng)抗原包被濃度為1：1000（即1 μg/ml），抗體稀釋為 1： 5000 倍時，OD 值為 1.983，滿足ELISA檢測時空白標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值要求，且抗原、抗體稀釋比例合適，固后續(xù)實驗均按此濃度進(jìn)行。

2.3 ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制如圖1所示，該回歸曲線的線性相關(guān)系數(shù)為R=0.995，線性相關(guān)顯著。

圖1 本研究所建立的ELISA標(biāo)準(zhǔn)品測定曲線

2.4 方法性能評價

2.4.1 特異性

表2 方法特異性評估結(jié)果

分別以常見的豬源蛋白及牛源蛋白代替豬IgG測定其標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算50%抑制濃度計交叉反應(yīng)率，結(jié)果如表2所示。由表2可知，方法對于豬IgG外的其他蛋白質(zhì)無顯著交叉反應(yīng)，特異性良好。

2.4.2 最低檢測限

連續(xù)測定20份不含豬IgG的空白樣品（見表3），以測定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為本方法的最低檢測限。經(jīng)計算，本方法的最低檢測限為10 μg/g。

表3 方法最低檢測限

2.4.3 回收率及精密度

取不含豬IgG的蛋白粉樣品用豬IgG標(biāo)準(zhǔn)品以10（1%）、100（10%）、200 mg/g（20%）含量水平進(jìn)行添加，每個添加濃度測定5個樣品，每個樣品測定3次，記錄測定結(jié)果并計算回收率及變異系數(shù)，結(jié)果見表4。

表4 方法定量限、回收率及精密度測定

3 討論

從方法的建立過程來看，制備特異性好、靈敏度合適的單克隆抗體最為關(guān)鍵。豬IgG是大分子蛋白，免疫原性好，經(jīng)過2次免疫后就得到了較高的血清效價。為了使最終產(chǎn)生的抗體穩(wěn)定性更好，最終選擇4次免疫后融合細(xì)胞。第一次篩選中細(xì)胞陽性率較高，但在后續(xù)篩選時部分丟失，原因不明。由于血漿蛋白粉中IgG含量一般在1%～25%，其對檢測方法的靈敏度要求不高，所以最終選擇了靈敏度為0.3 μg/ml的單克隆抗體。

雙抗體夾心ELISA法是檢測大分子蛋白常用的方法，其建立過程復(fù)雜，需要篩選兩個針對不同抗原表位的抗體。本研究選擇以間接競爭ELISA為原理，只需要篩選出一個合適的抗體?；诓恍枰哽`敏度的前提，方法建立過程大大簡化。

豬血漿蛋白粉作為優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料，在斷奶仔豬的飼養(yǎng)中非常重要。IgG作為其營養(yǎng)指標(biāo)，測定技術(shù)也較多，尤其是免疫單擴散法在血漿蛋白粉生產(chǎn)企業(yè)中應(yīng)用廣泛。單擴法優(yōu)點在于所用試劑簡單，無須特殊儀器，其缺點是耗時長，重復(fù)性差，定量效果差，這與企業(yè)測定IgG含量的出發(fā)點相沖突。GB/T21033—2007所規(guī)定的HPLC方法測定時耗費試劑、耗材、儀器等，費用昂貴。其中單個Hi-Trap親和柱價格在萬元左右，而HPLC儀器本身價格國產(chǎn)的需要十多萬元，在基層難以推廣應(yīng)用。

本研究所建立的間接競爭酶聯(lián)免疫法是基于抗豬IgG單克隆抗體，具有特異性好，測定范圍廣的特點，基本滿足了豬血漿蛋白粉中IgG含量的測定，尤其是檢測時間僅需要45 min，能同時檢測42個樣品（雙孔平行對照），在基層檢測中有廣泛的應(yīng)用前景。

[1]程忠剛.血漿蛋白的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].中國飼料,1998(12)：20-21.

[2]陳冬星,成國輝,俞湘麟，等.添加噴霧干燥的血漿蛋白粉飼喂仔豬試驗[J].中國畜牧雜志，2000(5)：36-37.

[3]劉娜.淺談血漿蛋白粉質(zhì)量評定[J].飼料博覽,2007,17:45-47.

[4]GB/T 21033—2007飼料中免疫球蛋白IgG的測定-高效液相色譜法[S].中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn),2007.

[5]楊利國,胡少昶,魏平華，等.酶免疫測定技術(shù)[M].南京:南京大學(xué)出版社，1998.