紅豆草ISSR體系優(yōu)化及其在航天誘變種質(zhì)鑒定中的應(yīng)用

沈紫微,陳本建,康俊梅,魏小蘭,張?zhí)N薇

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院,甘肅蘭州 730070；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所,北京 100193；3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,北京 100193）

隨著航天技術(shù)的發(fā)展,空間生命科學(xué)的研究逐漸引起科學(xué)家的重視。我國從20世紀(jì)80年代才開始用返回式衛(wèi)星和高空氣球搭載種子進行航天誘變育種研究。1987年我國在發(fā)射的第9顆返回式衛(wèi)星上首次進行了將蔬菜等農(nóng)作物種子搭載上天的試驗[1]。20世紀(jì)90年代以后報道[2-6]日趨增多。許多科技工作者通過航天搭載和地面選育相結(jié)合選育出了一批優(yōu)良新品種[7-9],證實航天育種在新品種選育方面具有十分廣闊的前景,是創(chuàng)造新突變型的一條新途徑。

紅豆草（Onobrychis viciaefolia）是豆科紅豆屬多年生草本植物,原產(chǎn)于歐洲,在我國許多地方引種栽培,效果良好。其適生于酸性土壤的森林草原,抗旱性、抗寒性和抗病蟲害能力均較強。由于其富含蛋白質(zhì)、氨基酸,且粗脂肪、鈣和磷含量較高,莖葉繁茂,草質(zhì)柔軟,為各類家畜和家禽所喜食,因此具有“牧草皇后”的美譽。除此之外,紅豆草根系極為發(fā)達,根瘤菌較多,對改良土壤有重要作用[10]。然而,目前對紅豆草的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)所知甚少。

作為眾多新型分子標(biāo)記技術(shù)中的一種,簡單重復(fù)序列間區(qū)（inter-simple sequence repeatI,SSR）,是由Zietkiewicz等[11]1994年提出的微衛(wèi)星分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記,用于檢測SSR間DNA序列差異。雖然ISSR技術(shù)提出時間不久,但已廣泛應(yīng)用于包括草業(yè)在內(nèi)的很多領(lǐng)域。2005年Mcroberts等[12]用 ISSR對4個印度哈里亞納邦一年生的某雜草種子進行多態(tài)性分析。2007年肖海峻和徐柱[13]用ISSR技術(shù)研究了90份鵝觀草（Roegneria klamojii）材料,發(fā)現(xiàn)其遺傳多樣性指數(shù)的大小與其所處生境的緯度、海拔高度和年均降雨量的相關(guān)性達到顯著或極顯著。2007年Li等[14]用4種分子標(biāo)記方法對中國東北的松嫩平原上的野大麥（Hordeum brevisubulatum）品種進行了多態(tài)性分析。另外,有關(guān)ISSR的分子標(biāo)記技術(shù)在冰草屬（Agropyron）和雀麥屬（Bromus）中也有所應(yīng)用[15]。可見,ISSR標(biāo)記是揭示植物遺傳多樣性,進行QTL定位和分子作圖的有效手段。但到目前為止,除有關(guān)于航天搭載紅豆草生理生化變異方面研究[16]的報道外,運用分子標(biāo)記技術(shù)研究航天搭載紅豆草遺傳物質(zhì)變異情況鮮見報道。本研究以航天搭載的紅豆草種子播種的植株為試驗材料,利用正交試驗設(shè)計,對紅豆草ISSR反應(yīng)體系進行優(yōu)化分析,并對53個ISSR引物進行篩選,以期獲得適合于紅豆草的ISSR反應(yīng)體系；同時利用已優(yōu)化好的ISSR體系及篩選出的引物對航天搭載及對照材料進行分子標(biāo)記,檢測在空間環(huán)境影響下航天搭載材料的基因組DNA的變異情況,以期為今后構(gòu)建紅豆草ISSR圖譜奠定基礎(chǔ),對今后深入研究紅豆草航天誘變機理提供重要參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料本試驗所用紅豆草材料來自北京海淀區(qū)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)上莊試驗地。2006年精選紅豆草種子,一部分搭載“實踐八號”育種衛(wèi)星,于9月9日在酒泉衛(wèi)星發(fā)射中心升空,衛(wèi)星在近地點187 km、遠地點463 km的近地軌道運行,于9月24日返回地面。另一部分貯存于地面常溫條件下,作為對照。于2008年溫室育苗,移栽于試驗地。2009年9月選取紅豆草變異單株75株及地面對照14株,采集幼嫩葉片作為供試材料。用冰盒迅速帶回,放置于-20℃冰箱保存。

1.2 基因組DNA的提取和檢測采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bro-mide,CTAB）法提取基因組DNA,并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度,最后將樣品質(zhì)量濃度稀釋至50 ng/μ L,置于-20℃冰箱保存。其中75株變異植株采用單株提取DNA的方式,對照植株按單株提取DNA的方式提取了田間14株普通植株葉片。

1.3ISSR-PCR反應(yīng)體系正交試驗設(shè)計采用加拿大哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia,UBC）所設(shè)計的ISSR通用引物,其中808號引物適合于多種植物,以其為固定引物進行反應(yīng)體系的構(gòu)建[17-21]。采用L9（34）正交設(shè)計表,根據(jù)相關(guān)文獻[17-20]的ISSR-PCR反應(yīng)體系,首先對dNTP、引物濃度、Taq酶濃度、Mg2+濃度進行4因素 3水平的探索正交試驗（表 1、表2）,再根據(jù)探索正交試驗的結(jié)果縮小各個因素的濃度梯度,進行細調(diào)正交試驗。除表中變化因素外,每管（25 μ L體系）中還含有 1×buffer和 50 ng模板DNA,試驗設(shè)2次重復(fù),取對照植株葉片DNA作供試樣本。ISSR引物購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司,dNTP及TaqDNA聚合酶均購自大連寶生物（TaKaRa）工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

表1 探索正交試驗水平—因素

表2 探索正交試驗設(shè)計表-L9（34） μ L

1.4PCR反應(yīng)程序利用正交試驗設(shè)計構(gòu)建適合紅豆草的ISSR-PCR最優(yōu)反應(yīng)體系。PCR擴增反應(yīng)在PTC-200（MJ Research Peltier T hermal Cycler,USA）PCR儀上進行,擴增程序為:94℃預(yù)變性3 min,94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸2 min,進行35個循環(huán),最后72℃再延伸4 min,然后置于4℃保存。擴增反應(yīng)結(jié)束后,取5.0 μ L 擴增產(chǎn) 物,加入 1.0 μ L 上 樣緩沖液（6%溴酚藍）,然后在2%的瓊脂糖凝膠上點樣,5 V/cm電泳1～1.5 h,最后在紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國BIO-RAD公司生產(chǎn)）上觀察并照相。

1.5引物篩選與最佳退火溫度的確定在已優(yōu)化好的體系的基礎(chǔ)上篩選引物及最佳退火溫度。所用引物參照加拿大哥倫比亞大學(xué)公司公布的ISSR引物序列[22],從相關(guān)文獻中找出較為適合紅豆草的53個引物,經(jīng)過PCR擴增篩選,選出擴增條帶較多、信號強、背景清晰的引物,由上海生物工程公司（Sangon）合成。然后針對篩選出的引物,使用 T-Gradient（Biometra）梯度 PCR儀,對各個引物進行最佳退火溫度的篩選。試驗設(shè) 12 個退火溫度梯度 :46.0、46.3、47.3、48.8、50.5、52.2、53.8、55.5、57.2、58.7、59.7和 60.0 ℃。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析電泳圖譜中的每一條帶均為1個分子標(biāo)記,代表在模板上有1個引物結(jié)合位點,對凝膠上的帶進行統(tǒng)計,按照電泳圖譜中同一位置上帶的有無進行統(tǒng)計,有帶的記為1,無帶的記為0,獲得二元數(shù)據(jù)矩陣。利用 POPGENE32軟件[23]計算多態(tài)位點百分率（P）,Nei基因多樣性指數(shù)（h）,Shannon多態(tài)性信息指數(shù)（I）。

2 結(jié)果與分析

2.1ISSR-PCR反應(yīng)體系的構(gòu)建與優(yōu)化

2.1.1ISSR-PCR正交試驗設(shè)計的探索性正交試驗結(jié)果與分析 各處理組合結(jié)果具有明顯差異。1、3號處理均有1個重復(fù)未擴增出條帶,2號處理擴增條帶不清晰,5、8、9號處理重復(fù)性不太好,說明這些組合反應(yīng)體系穩(wěn)定性不高或不適宜組合（圖1）。可能由于試驗設(shè)計的各個因素梯度較大 ,有些處理偏離最優(yōu)組合較遠。但4、6、7號處理組合,尤其是4號處理組合重復(fù)性好,條帶多且清晰（圖1）,說明距最優(yōu)組合偏差不大。再以其為基點,縮小各個因素的濃度梯度進行細調(diào)正交試驗。

2.1.2ISSR-PCR正交試驗設(shè)計的細調(diào)性正交試驗結(jié)果與分析 細調(diào)正交試驗的各因素濃度范圍調(diào)整為dNTP 0.1～0.3 mmol/L,Taq酶0.5～2.5 U,Mg2+2.0～3.0 mmol/L,引物 0.2～0.4 μ mol/L。結(jié)果顯示,每一處理組合基本都可擴出數(shù)條條帶。其中1、2、3和 9號條帶較弱,且多態(tài)性不高；4、6、9號處理重復(fù)性不好,說明其反應(yīng)體系不太穩(wěn)定。試驗效果最好的是5和8號處理組合,擴增條帶較清晰、重復(fù)性也好,為最佳的處理組合（圖2）。

圖1 ISSR-PCR探索正交試驗結(jié)果

圖2 ISSR-PCR細調(diào)正交試驗結(jié)果

參照張麗等[24]的方法,對各組分濃度組合的正交試驗結(jié)果進行了正交直觀統(tǒng)計分析（表3）,結(jié)果顯示,在選定的3個水平范圍內(nèi),Mg2+、dNTP、引物和Taq DNA聚合酶4個因素對結(jié)果的影響依次為引物＞dNTP＞TaqDNA聚合酶＞Mg2+。從最佳濃度確定值結(jié)果來看,dNTP以水平2好,Taq DNA聚合酶以水平2好,引物以水平3好,Mg2+以水平3好,由此可得最佳理論處理組合為:dNTP 0.2 mmol/L、Taq DNA 聚合酶1.5 U 、引物0.4 μ mol/L 、Mg2+3 mmol/L 。

該組合與細調(diào)正交試驗結(jié)果選出的最佳組合5最接近,僅Mg2+的濃度有差異,其他各組分濃度均一致；其次與組合8也較接近,二者的Mg2+濃度和Taq DNA聚合酶濃度均一致,僅dNTP和引物存在差異。為了進一步驗證,將該理論組合與5號及8號處理組合進行比較,所用的DNA模板為隨機選取的6份誘變材料DNA。結(jié)果顯示（圖3）,這3個擴增體系條帶基本一樣,但5號組合擴增出的有些條帶明顯較亮,且擴增條帶數(shù)較多。因此,進一步確定組合5為最優(yōu)組合,選用其為正式試驗的ISSR-PCR反應(yīng)體系。

表3 ISSR-PCR細調(diào)正交試驗結(jié)果直觀分析

圖3 3種反應(yīng)體系結(jié)果的比較

2.2 引物及其最佳退火溫度的篩選對53個引物進行篩選,最終篩選出12個條帶清晰,多態(tài)性較好的引物,同時確定了各引物的最佳退火溫度（表4）,部分結(jié)果見圖 4、5。在這 12條引物中（AG）n有5條,（GA）n有1條,（AC）n有2條,說明紅豆草基因組中存在大量的（AG）、（GA）、（AC）二核苷酸重復(fù)序列。

2.3ISSR初步分析遺傳多樣性利用已優(yōu)化好的紅豆草ISSR-PCR反應(yīng)體系對試驗材料進行遺傳多樣性分析。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測分析,經(jīng)過12個引物擴增,記錄的條帶大小范圍為300～1 000 bp,共獲得193個擴增位點（表5）,其中多態(tài)性位點142個,多態(tài)性比率為73.6%,每個引物的擴增位點為10～23個,平均16.1個,其中多態(tài)性位點7～18個,平均11.8個,部分結(jié)果見圖6。

表4 引物及最佳退火溫度篩選結(jié)果

圖4 引物834最佳退火溫度的確定

圖5 引物836最佳退火溫度的確定

圖6 引物UBC808對紅豆草部分樣品基因組DNA的ISSR-PCR擴增結(jié)果

為了進一步分析搭載和對照之間遺傳變異的差別,在75株變異單株中隨機抽取14株,與14株對照植株一起獲得搭載植株與對照植株的二元數(shù)據(jù)矩陣,利用POPGENE32軟件分析。航天誘變植株多態(tài)位點百分率為（P）68.60%,Nei基因多樣度為0.374 3,Shannon多樣性指數(shù)為0.555 6；而地面對照多態(tài)位點百分率為41.50%,Nei基因多樣度為0.256 8,Shannon多樣性指數(shù)為0.414 7,均低于航天誘變種,表明航天誘變增加了紅豆草遺傳變異。

表5 ISSR分子標(biāo)記擴增結(jié)果

3 討論

空間環(huán)境中的強輻射、微重力和超真空等特殊環(huán)境可引起植物及其后代發(fā)生變異,包括形態(tài)學(xué)變異、細胞學(xué)變異、生理生化變異及遺傳物質(zhì)的變化等[25]。ISSR是由SSR（simple sequence repeats）發(fā)展而來的一種新的分子標(biāo)記,操作簡單,檢測結(jié)果方便,并具有SSR的穩(wěn)定性,比RAPD具有更高的多態(tài)性,是檢驗分子水平上遺傳變異的好手段[26-27]。

ISSR標(biāo)記雖然結(jié)合了RAPD和SSR等分子標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點,具有較高的可重復(fù)性和穩(wěn)定性,但在PCR反應(yīng)中受反應(yīng)條件、擴增程序、供試材料不同的影響,其擴增結(jié)果差異也很大。如體系中各個因素間都會發(fā)生相互作用,從而影響試驗結(jié)果。因此,在試驗過程中必須采用穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系。本研究證明采用不同的體系組合對紅豆草ISSR-PCR擴增結(jié)果影響很大。通過對前人[28-30]所做的一些植物資源的ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化研究的總結(jié),在 Taq DNA聚合酶的用量上,本研究最后結(jié)果確定的用量為1.5 U。但大多數(shù)研究者[28-31]在考慮到Taq DNA聚合酶價格的基礎(chǔ)上,在節(jié)省成本的情況下均選擇1 U的用量。本研究在細調(diào)正交試驗設(shè)計中本欲縮小 Taq DNA聚合酶用量到1 U,但由于擴增條帶不理想,大多數(shù)泳道條帶較弱,有的甚至無條帶,故仍選擇1.5 U的用量。在dNTP的用量上,大多數(shù)研究結(jié)果的范圍均在0.15～0.30 mmol/L,并以0.2 mmol/L的用量居多[28,32-33],這與本研究的結(jié)果一致。在引物的用量上,各研究結(jié)果不一,但大多數(shù)體系的用量范圍在 0.2～0.5 μ mol/L[29-30,32-34]。本研究最終確定的引物濃度（0.4 μ mol/L）在此范圍之內(nèi)。在 Mg2+的用量上,大多數(shù)研究報道的用量范圍在 1.5～2.5 mmol/L[35],其中大多數(shù)體系對于Mg2+的用量最終確定為2.0 mmol/L,這與本研究結(jié)果一致。本研究最終利用正交試驗設(shè)計對紅豆草ISSRPCR反應(yīng)體系進行優(yōu)化,在擴增結(jié)果相差不大的情況下,盡可能選擇藥品使用量少、條帶清晰的泳道,從而確定了最佳反應(yīng)體系。

對53個引物進行篩選,最終篩選出12個條帶清晰、多態(tài)性較好的引物。由于影響ISSR分析中的PCR擴增的因素比較復(fù)雜,尤其是擴增程序中的退火溫度。較低的退火溫度允許適當(dāng)錯配,擴大了引物在基因組中配對的隨機性,而較高的退火溫度雖可提高配對的專一性,卻會影響引物與模板的結(jié)合程度。因此,隨機設(shè)置12個退火溫度梯度對各個引物進行最佳退火溫度的篩選,最終確定各引物的最佳退火溫度。

周桂元等[36]通過返回式衛(wèi)星搭載后的花生（Arachis hypogaea）種子,返回地面經(jīng)過多年的種植和選擇,在試驗中獲得21個變異株系。用SSR技術(shù)檢測21個變異株系的基因位點,發(fā)現(xiàn)多個基因位點發(fā)生了變異,并通過與形態(tài)變異的聯(lián)系,表明太空處理能夠誘導(dǎo)花生產(chǎn)生變異。類似的結(jié)果在水稻（Oryza sativa）、菜豆（Phaseolus vulgaris）和番茄（Lycopersicon esculentum）航天育種研究上也有報道[37-40]。本研究經(jīng)過12個引物擴增后,證明了空間環(huán)境對植物基因位點的影響,同時說明航天誘變的方法確實可引起植株分子水平上的遺傳變異,而非僅僅表面上的暫時性變異。說明航天誘變可作為今后紅豆草種質(zhì)資源創(chuàng)新和品種選育的方法之一。

4 結(jié)論

1）紅豆草ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系為:2.5 μ L 10×PCR buffer、50 ng 模板 DNA 、dNTP 0.2 mmol/L、Taq DNA 聚合酶 1.5 U、引物 0.4 μ mol/L 、Mg2+2.0 mmol/L,總體積為 25 μ L 。

2）通過瓊脂糖凝膠電泳檢測分析,共獲得193個擴增位點,其中多態(tài)性位點142個,多態(tài)性比率為73.6%,每個引物的擴增位點為10～23個,平均16.1個,其中多態(tài)性位點7～18個,平均11.8個。

3）搭載植株的多態(tài)位點比率、Nei基因多樣度和Shannon多樣性指數(shù)均高于地面對照。

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