支氣管哮喘大鼠淋巴液 CD4+CD25*+Treg及其Th1/Th2失衡的實(shí)驗(yàn)研究

趙志旭 馮學(xué)斌 李營營 吳福玲 楊 成

1濱州醫(yī)學(xué)院兒科學(xué)教研室 濱州市 256603;2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科;3濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心

支氣管哮喘大鼠淋巴液 CD4+CD25*+Treg及其Th1/Th2失衡的實(shí)驗(yàn)研究

趙志旭1馮學(xué)斌1李營營2吳福玲2楊 成3

1濱州醫(yī)學(xué)院兒科學(xué)教研室 濱州市 256603;2濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒科;3濱州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心

目的 觀察 CD 4+CD 25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞、IL-4和 IFN-γ在哮喘大鼠淋巴液與血液中的水平,探討其與哮喘發(fā)病的關(guān)系。方法 建立大鼠哮喘模型,收集激發(fā)后 0、24、48 h淋巴液、血液中淋巴細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測淋巴液及血液中CD 4+CD 25+Foxp3+T細(xì)胞百分率;采用ELISA方法檢測血漿及淋巴液中 IL-4和IFN-γ水平。結(jié)果 哮喘組淋巴液和血液的CD 4+CD 25+Foxp3+T細(xì)胞百分率水平、血漿 IL-4和 IFN-γ濃度在各時(shí)間點(diǎn)均低于對照組(P＜0.05);哮喘組淋巴液中CD 4+CD 25+Foxp3+T細(xì)胞百分率水平、IL-4和IFN-γ濃度在不同時(shí)間點(diǎn)均高于血液水平(P＜0.05)。結(jié)論 哮喘大鼠淋巴液中存在CD 4+CD 25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞數(shù)量失調(diào),且淋巴液中CD 4+CD 25+Foxp 3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞水平顯著高于其血液水平;哮喘大鼠淋巴液中存在以Th2亢進(jìn)為特征的Th1/Th2失衡,淋巴液中細(xì)胞因子水平對于反映哮喘炎癥程度可能更早和更準(zhǔn)確。

哮喘;調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞;白細(xì)胞介素 4;干擾素 γ

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是多種細(xì)胞和細(xì)胞組分共同參與的氣道慢性炎癥性疾病。業(yè)已證實(shí)哮喘存在嚴(yán)重的 T淋巴細(xì)胞亞群失衡現(xiàn)象和多種細(xì)胞因子的異常,諸多研究認(rèn)為 Th1/Th2細(xì)胞亞群的失衡是哮喘發(fā)病的核心環(huán)節(jié)。近年認(rèn)為 CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞在哮喘的發(fā)病中具有重要作用[1]。目前關(guān)于哮喘淋巴液中 CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié) T細(xì)胞、Th1/Th2亞群的變化及其規(guī)律尚不清楚。本研究通過建立哮喘大鼠淋巴液引流模型,觀察 CD4+CD 25+Foxp3+調(diào)節(jié) T細(xì)胞、IL-4、IFN-γ在淋巴液和血液中分布狀態(tài)及其差異,探討淋巴液中CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié) T細(xì)胞、Th1/Th2失衡的特點(diǎn)及其在哮喘免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí) SD大鼠 60只(山東綠葉制藥有限公司動(dòng)物中心提供),雌雄各半,體質(zhì)量 60～80 g,30日齡。隨機(jī)分為對照組(30只)和哮喘組(30只)。

1.2 主要試劑和儀器 卵白蛋白(OVA,Grade V、GradeⅡ,Sigma公司);氫氧化鋁(Aluminum hydroxide,分析純,北京化學(xué)試劑公司);淋巴細(xì)胞分離液(中國科學(xué)院天津試劑制造廠);FITC標(biāo)記的抗 CD4抗體,PE標(biāo)記的抗 CD25抗體,PE-cy5標(biāo)記的抗Foxp3(含配套的固定和透膜試劑,eBioscience公司 );IL-4、IFN-γ、IL-10 和 TGF-β ELISA試劑 盒(R＆D公司);JSC-OK型單雙通用水電分離式超聲波霧化器(遼寧省鞍山市電子醫(yī)療儀器廠);流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司);酶標(biāo)儀(美國 Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠哮喘模型的建立:參照文獻(xiàn)[2]的方法。實(shí)驗(yàn)組大鼠分別于實(shí)驗(yàn)第 1天、第 8天用新鮮配制的 OVA(GradeV)1 mg+氫氧化鋁 200mg+生理鹽水 1 ml混懸液在大鼠兩側(cè)腹股溝、腹部、前足跖 4個(gè)部位做皮下注射(每點(diǎn) 0.2ml),同時(shí)腹腔注射 0.2 ml。于第 15天,將大鼠置于 20 cm×20 cm×15 cm大小的密閉容器中,用 1%OVA進(jìn)行霧化吸入激發(fā),每次霧化 30min,連續(xù) 7 d。對照組大鼠以等量生理鹽水代替卵白蛋白,同法、同量、同期進(jìn)行致敏和激發(fā)。哮喘組、對照組大鼠分別于激發(fā)后 0、24、48 h收集取淋巴液和血液分離淋巴細(xì)胞進(jìn)行檢測。

1.3.2 大鼠淋巴液的采集:大鼠仰臥位,10%水合氯醛 3.0 ml/kg腹腔注射麻醉,常規(guī)消毒。于劍突恥骨聯(lián)合連線上 2/3作腹部正中切口,將腸內(nèi)容物移出腹腔,用溫鹽水紗布包裹。在右腎動(dòng)脈水平,腸系膜上動(dòng)脈處尋找腸系膜淋巴干。用留置針插入淋巴管,收集 0.5m l淋巴液。常規(guī)分離淋巴液中淋巴細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106/ml。

1.3.3 大鼠血液的采集:打開胸腔,心臟無菌穿刺采血 5m l,置于肝素離心管內(nèi),常規(guī)分離液分離淋巴細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為 1×106/ml。

1.3.4 淋巴液、血液中 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率的流式細(xì)胞儀檢測:取上述細(xì)胞懸液 100μl,加入 CD4-FITC和 CD25-PE,混勻 4°C避光孵育 30 min,用細(xì)胞染色緩沖液洗 1次,加入新鮮配置的 1 m l Fix/Perm工作液混勻,4°C避光孵育 45 min,1×Perm緩沖液洗 2次,加入 Foxp3-PEC-y5(同時(shí)設(shè)同型對照反應(yīng)管),4°C避光孵育 30 min,1×Perm緩沖液洗 2次,用細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞上機(jī)分析。以 FSC和 SSC設(shè)門圈定淋巴細(xì)胞,根據(jù)三種發(fā)射波長建立通道,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 WinMDI 2.9軟件分析。

1.3.5 淋巴液 、血漿中 IL-4、IFN-γ檢測:采用ELISA方法,試劑盒由上海博蘊(yùn)生物科技有限公司提供,R＆D公司生產(chǎn)。操作方法見說明書。

1.3.6 肺組織標(biāo)本留取及組織形態(tài)學(xué)觀察:充分暴露胸腔,觀察肺臟大體病理改變。左肺上葉注入4%多聚甲醛 5 ml,取下置于 4%多聚甲醛中固定 1周。取固定的肺組織常規(guī)石蠟包埋、切片,常規(guī) HE染色,普通光學(xué)顯微鏡下觀察肺臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果

2.1 哮喘組大鼠臨床癥狀及組織病理學(xué)觀察 哮喘組大鼠在卵白蛋白激發(fā)過程中,表現(xiàn)出蜷伏不動(dòng),呼吸急促,口唇爪有不同程度紫紺,張口呼吸,大小便失禁,連續(xù)激發(fā)后毛色失去光澤,煩躁不安。刺激數(shù)天后部分大鼠癥狀逐漸加重。對照組大鼠無上述變化。光鏡下哮喘肺組織支氣管黏膜增厚,大量炎性細(xì)胞浸潤,管腔狹窄,肺泡上皮細(xì)胞破壞;對照組大鼠支氣管壁光滑、完整,支氣管、血管周圍未見炎性細(xì)胞浸潤。哮喘組支氣管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒細(xì)胞百分率、血漿中 OVA特異性 IgE抗體均明顯高于對照組(P＜0.05),哮喘組血漿中 IL-4濃度較對照組顯著升高,而 IFN-γ則顯著降低,IL-4/IFN-γ比值增高。上述指標(biāo)表明哮喘模型復(fù)制成功。

2.2 淋巴液和血液 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率比較 哮喘組大鼠激發(fā)后 0、24、48 h各時(shí)間點(diǎn)的淋巴液與血液 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率水平均低于對照組,哮喘組和對照組大鼠的淋巴液CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率平均水平均高于其血液水平,其淋巴液水平分別是血液的 1.49倍、1.62倍 (見表 1)。

表1 淋巴液和血液中 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率比較(%)

2.3 淋巴液和血漿 IL-4水平比較 哮喘組大鼠激發(fā)后 0、24、48 h各時(shí)間點(diǎn)的淋巴液及血漿 IL-4水平均較對照組顯著升高,哮喘組、對照組大鼠的淋巴液IL-4平均水平均高于其血漿水平,其淋巴液水平分別是血漿的 1.8倍、2.3倍(見表 2)。

表2 淋巴液、血漿中 IL-4的水平比較(ng/L)

2.4 淋巴液和血漿 IFN-γ水平比較 哮喘組大鼠激發(fā)后 0、24、48 h各時(shí)間點(diǎn)的淋巴液及血漿 IFN-γ水平均較對照組顯著降低,哮喘組、對照組大鼠的淋巴液 IFN-γ平均水平均高于血漿水平,其淋巴液水平分別是血漿的 3.0倍、2.1倍(見表 3)。

表3 淋巴液、血漿中 IFN-γ的水平比較(ng/L)

3 討論

目前認(rèn)為哮喘存在嚴(yán)重 T淋巴細(xì)胞亞群失衡現(xiàn)象和多種細(xì)胞因子的異常[3],其中 Th1/Th2失衡是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。諸多研究表明[4～6],哮喘患兒外周血、BALF中均能檢測到 Th2類細(xì)胞因子的升高。近年發(fā)現(xiàn) CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié) T細(xì)胞在哮喘發(fā)病中發(fā)揮重要作用。已有研究證實(shí),在體外用抗原刺激后,人類 CD4+CD25+Treg細(xì)胞可以抑制 CD4+T細(xì)胞增殖和 Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生,提示 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞免疫功能可能是抑制Th2細(xì)胞對環(huán)境抗原的不適當(dāng)應(yīng)答。有研究報(bào)道哮喘患兒 BALF中 CD4+CD25+Treg比例較正常對照組顯著降低[7],并且調(diào)節(jié)免疫功能下降[8]。而在氣道內(nèi)吸入 CD4+CD25+Treg可以抑制哮喘大鼠 T細(xì)胞的活化和氣道高反應(yīng)性[9],表明哮喘患者存在CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量不足及功能降低。目前,關(guān)于哮喘 CD4+CD25+Treg研究僅限于血液及肺組織,而對于哮喘淋巴液中 CD4+CD25+Treg的數(shù)量及其功能方面研究尚未見報(bào)道。

淋巴系統(tǒng)是機(jī)體重要的免疫系統(tǒng),淋巴液的循環(huán)對機(jī)體正常活動(dòng)的維持和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要意義。淋巴細(xì)胞捕獲抗原,產(chǎn)生效應(yīng)性細(xì)胞,清除外來過敏原,并通過淋巴回流機(jī)制,進(jìn)入血液系統(tǒng),進(jìn)一步消耗血液內(nèi)抗原。我們課題組前期的研究已證實(shí)哮喘大鼠淋巴液中 IL-4、IFN-γ、IL-12水平均高于BALF和血漿,且出現(xiàn)高峰均早于 BALF和血漿[10];哮喘大鼠淋巴液中存在明顯的淋巴細(xì)胞早期凋亡障礙和 Fas/FasL表達(dá)降低,尤其是哮喘淋巴液中淋巴細(xì)胞凋亡障礙和 Fas/FasL降低程度較其血液、BALF更為明顯[11]。這些均提示哮喘發(fā)病時(shí)細(xì)胞因子及淋巴細(xì)胞凋亡等免疫功能紊亂可能最早源于淋巴系統(tǒng)。本文研究表明哮喘組大鼠各時(shí)間點(diǎn)淋巴液與血液 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率水平均低于對照組。無論哮喘組還是對照組和治療組,大鼠淋巴液中 CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞百分率水平均高于其血液水平,表明哮喘大鼠淋巴液存在明顯的CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞數(shù)量的不足。

IL-4和 IFN-γ是 Th1、Th2產(chǎn)生重要免疫效應(yīng)的細(xì)胞因子,在一定程度上反映 Th1、Th2細(xì)胞亞群的功能狀態(tài)。IL-4是 CD4+和 CD8+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為 Th2的關(guān)鍵細(xì)胞因子,能促進(jìn)Th0細(xì)胞分化為 Th2細(xì)胞。采用敲除 IL-4基因的小鼠,T細(xì)胞及其亞群發(fā)育雖然正常,但不能誘導(dǎo) Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生,故 IL-4被認(rèn)為是 Th2轉(zhuǎn)化的必需因子[12]。而 IFN-γ可促使 Th0細(xì)胞向Th1方向分化,并抑制 Th2克隆分化,能夠顯著提高巨噬細(xì)胞的抗原呈遞能力[13],并抑制IL-4mRNA的表達(dá),同時(shí)還抑制 IL-4介導(dǎo)的 B細(xì)胞表達(dá) FcεRⅡ和分泌 sFcεRⅡ,從而抑制了 IL-4誘導(dǎo)的 IgE的合成過程[14],而發(fā)揮抗炎作用。本研究表明哮喘大鼠淋巴液中 IL-4水平較對照組顯著增高,而哮喘大鼠淋巴液中 IFN-γ水平明顯低于對照組,提示哮喘大鼠淋巴液中存在以 IL-4增高為特征的Th2功能亢進(jìn)和以 IFN-γ水平降低為標(biāo)志的 Th1功能降低,同時(shí)由于 IFN-γ水平降低,導(dǎo)致 Th0向 Th1方向分化受阻,從而加劇了 Th2功能亢進(jìn)狀態(tài)。無論哮喘組還是對照組,大鼠淋巴液中 IL-4、IFN-γ水平均高于其血液水平。提示 Th1、Th2類細(xì)胞因子的失衡可能是促進(jìn)哮喘炎癥反應(yīng)的重要因素之一。

本研究從淋巴液水平證實(shí)哮喘大鼠淋巴液存在CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞數(shù)量的不足和嚴(yán)重的 Th1/Th2失衡狀態(tài),此可能是哮喘重要免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制之一。由于淋巴液中 Th1、Th2類細(xì)胞因子水平顯著高于其血漿水平,故推測淋巴液中細(xì)胞因子水平可能更早、更準(zhǔn)確地反映機(jī)體哮喘炎癥程度。因此,深入研究淋巴液中 T細(xì)胞亞群數(shù)量及其功能的失調(diào),對于從調(diào)整 CD4+CD 25+Foxp3+調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞功能入手,尋求哮喘防治新途徑可能有重要的理論和實(shí)踐價(jià)值。

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Study on CD 4+CD 25+Treg and the imbalance of Th1/Th2 cytokinesin lymph in bronchial asthmatic rat

ZHAO Zhixu1FENG Xuebin1LIYingying2WU Fuling2YANG Cheng3
1 Department of Pediatrics,Binzhou Medical University,Binzhou 256603;2Department of Pediatrics,Affiliated Hospital of Binzhou Medical University;3 Core Laboratory,Binzhou Medical University

ObjectiveTo observe the expression of CD 4+CD 25+Foxp3+Treg、IL-4 and IFN-γin lymph and blood,investigate the relationship between them.MethodsLymph and blood samples of 0 h,24 h,48 h after the last challenge were collected from the rat model of asthma.The percentage of CD 4+CD 25+Foxp3+Treg were detected by flowcy to meter(FCM),while the levels of IL-4 and IFN-γwere determined by ELISA.ResultsThe percentage of CD4+CD25+Foxp3+Treg in the blood and the levels of IL-4 and IFN-γin the plasma in cases of asthma group were significantly lower than that of the control at different time points(P＜0.05);The percentage of CD 4+CD 25+Foxp3+Treg and the level of IL-4and IFN-γin lymph were significantly higher than thatof blood(P＜0.05).ConclusionThere is a disbalance both quantity of CD4+CD25+Foxp3+Treg in the lym ph of bronchial asthmatic rat,and the percentage of CD 4+CD 25+Foxp3+Treg in lymph are significantly higher than that of blood.It is suggested that the Th1/Th2 unbalance which was impress of Th2hyperfunction were existed in lymph ofasthmatic rats.It could suppose that cytokines levels in lymph could reflex to the in flammation degree of asthmamuch early and accurately.

asthma,regulatory T cell,interleukin-4,interferon-γ

R562.2

A

1001-9510(2010)01-0001-04

項(xiàng)目:山東省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.J07YE 14)

馮學(xué)斌,E-mail:fxbbzmc@163.com

2009-10-21)