36例血友病A相關(guān)抑制物檢測分析

伍柏青，程洪波，龔旭疆

(江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330006)

血友病A又稱凝血因子Ⅷ缺乏癥，是一種臨床上最常見的由于FⅧ基因突變所引起的X染色體隱形遺傳性出血性疾病 。目前臨床上以替代治療為主，即間斷輸注外源性凝血因子Ⅷ以維持機體正常的凝血功能，但少數(shù)患者在經(jīng)過若干次Ⅷ因子制劑的輸注后，可產(chǎn)生抗Ⅷ因子抗體，使外源性凝血因子Ⅷ失活而影響治療效果，該抗體被稱為凝血因子Ⅷ抑制物。本研究對36例血友病A患者進行FⅧ抑制物定性及定量分析，從而判斷患者抗體存在狀況，進而指導(dǎo)臨床診斷和治療，現(xiàn)報告如下。?

材料與方法

1研究對象 資料來源于2009年11月～2010年8月間，我院血液科收治的診斷明確、資料完整的血友病A患者36例，均為男性患者，年齡范圍從1歲～50歲，13歲以下26例。

2試劑與儀器 標(biāo)準(zhǔn)人類血漿、因子Ⅷ活性測定試劑、APTT試劑、PT試劑、氯化鈣溶液等試劑購自德國SIEMENS公司,所有檢測在日本Sysmex CA-7000全自動血凝分析儀上進行。

3 方法

3.1 血友病A確診試驗 每個病人進行PT、APTT、和VIII:C測定。

3.2 血友病A抑制物定性試驗

3.2.1 取20份以上無黃疸、無溶血、無脂濁且APTT結(jié)果范圍為28～32s的血漿混合在一起，制成正常混合血漿備用。

3.2.2 準(zhǔn)備3個塑料試管分別標(biāo)記A、B、C，在A管內(nèi)加入0.5ml正常混合血漿，B管內(nèi)加入0.5ml血友病A患者血漿，C管內(nèi)加入正常混合血漿和血友病A患者血漿各0.2ml。將3管血漿均37℃孵育2h，再將A管和B管1:1混合形成D管。即刻對A、C、D管進行APTT檢測。

3.2.3 結(jié)果判斷 C管APTT結(jié)果與A管相差10s以上，且C管APTT結(jié)果明顯長于D管，說明血漿中存在時間依賴性凝血因子抑制物，即FVIII抑制物定性試驗陽性。

3.3 Nigmegen方法定量檢測抗體

3.3.1 抗體單位定義 37℃孵育2h后，中和正常血漿(FVIII活性100%)中50%的FVIII所需抑制物的量為1BU。

3.3.2 Nijmegen混合血漿的制備 采集20份健康人全血各5ml(以咪唑枸櫞酸鈉抗凝)，立即分離血漿，混合后備用。

3.3.3 Nijmegen血漿定標(biāo) 將上述制備的混合血漿FVIII活性調(diào)整為100%后，加等量的乏VIII因子血漿混勻作為標(biāo)準(zhǔn)品進行定標(biāo)。

3.3.4 抑制物定量檢測 將患者血漿用緩沖液稀釋，再加入等量Nijmegen血漿后置于37℃水浴2h(加蓋)。用一期法進行因子活性檢測，檢測各管的FVIII:C水平。

3.3.5 取最接近50%活性的稀釋度，利用計算公式log(100/50)(100/Ⅷ:C)，然后乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為該份標(biāo)本的抗體滴度。

結(jié) 果

1 全部36例血友病A患者PT、APTT、和FVIII:C 以及抑制物定性試驗和定量結(jié)果見表1。表中所示：A為正?；旌涎獫{APTT結(jié)果；C為混合血漿和患者血漿1:1混合再孵育后APTT結(jié)果；D為混合血漿和患者血漿孵育后再1:1混合的APTT結(jié)果。

表1 36例血友病A檢測結(jié)果

2抑制物定性試驗結(jié)果：07、28號患者存在時間依賴性凝血因子抑制物，定性試驗陽性，其它均為陰性。

3抑制物定量結(jié)果：

07 抗體計算：log(100/50)(100/49.1)×32(稀釋倍數(shù))=log10(100/49.1)/log10(100/50)×32=0.3089/0.3010×32≈33BU

28 抗體計算：log(100/50)(100/51.6)×64(稀釋倍數(shù))=log10(100/51.6)/log10(100/50)×64=0.2874/0.3010×64≈61BU

討論

血友病A是X染色體連鎖的隱形遺傳性疾病，女性常是攜帶者(患者極為罕見)，而男性則是患者。其發(fā)病率各國報道不一，國外報道為(4.6～14)/10萬，我國1999年邵宗鴻等報道為 (1.95～2.40)/10萬，而世界衛(wèi)生組織(WHO)和世界血友病聯(lián)盟(WFH)的資料顯示，血友病A的發(fā)病率約為1/10000，其中重型的發(fā)生率為1/16000[1]。血友病A的主要臨床表現(xiàn)是自幼反復(fù)發(fā)生多處組織器官異常出血，其中關(guān)節(jié)出血是最常見且具有特征性的出血表現(xiàn)，也是血友病患者致殘的主要原因[2]。本文收集的36例患者均有不同程度的出血，關(guān)節(jié)因出血畸形的有5例，其中1例為雙踝關(guān)節(jié)蹠屈位跟骨截骨手術(shù)患者，該患者圍手術(shù)期使用了大量Ⅷ因子，但連續(xù)的FⅧ抑制物監(jiān)測始終陰性。

血友病A的診斷主要依賴實驗室的診斷，一般分為篩選試驗：活化部分凝血活酶時間(APTT)，確診試驗：Ⅷ因子活性檢測(FⅧ:C)；而血友病A的抑制物檢測則有定性試驗(APTT糾正試驗)和抗體定量檢測，定量檢測方法主要有經(jīng)典的Bethesda方法和改良的Nijmegen方法，Nijmegen方法是在前者的基礎(chǔ)上進行改進，將患者血漿用緩沖液稀釋后加正常人混合血漿(咪唑枸櫞酸鈉抗凝)共同溫浴以保證檢測體系pH值的穩(wěn)定，結(jié)果更加可靠，適合低滴度抗體的檢測[3]。

血友病A的治療主要有替代治療和基因治療兩種，由于基因治療效果和安全性方面還存在一定的不足，目前臨床上治療仍以輸注血源性或基因重組FⅧ制劑為主。但有少數(shù)患者輸注替代FⅧ后會產(chǎn)生中和抗體，這種抗體嚴重影響FⅧ輸注效果，尤其是患者發(fā)生大出血時，不能通過輸注FⅧ來有效提高患者血液中FⅧ濃度，直接威脅患者生命安全。因此，F(xiàn)Ⅷ抑制物的檢測對進行替代治療的患者就顯得尤為重要。本研究針對我院資料完全的血友病A患者在多次輸注FⅧ制劑后，進行抑制物檢測，觀察有無抗體的產(chǎn)生，評估其治療效果。36例患者抑制物定性試驗陽性的2例，再進行抗體定量檢測，抗體分別為33BU和61BU。

FⅧ抑制物是臨床上最常見的引起出血的凝血因子抑制物，產(chǎn)生主要受遺傳和環(huán)境因素影響，其中遺傳因素包括：FⅧ基因突變、疾病的嚴重程度，抑制物家族史，種族和HLA基因型等；環(huán)境因素包括：首次使用FⅧ制劑的年齡，F(xiàn)Ⅷ暴露天數(shù)、患者免疫狀態(tài)及伴隨炎癥因素等[4-7]。FⅧ抑制物存在的患者往往出血癥狀突然加重，頻率增加，以往的治療常發(fā)生無效的現(xiàn)象。治療原則為迅速止血和清除抗體，考慮抑制物的滴度和患者的出血情況。止血主要采用的生物制劑和藥物有：人FⅧ濃縮物、重組的FⅧ濃縮物、豬FⅧ濃縮物以及FⅧ旁路制劑(活化凝血酶原復(fù)合物濃縮劑、重組活化的FⅦ)，清除抗體使用的方法有血漿置換、免疫耐受等[1]。我們檢出的存在抑制物的患者臨床觀察發(fā)現(xiàn)用常規(guī)治療方法效果較差，出血仍在繼續(xù)。但在加大輸注Ⅷ因子和使用一些清除抗體的方法，病情有所好轉(zhuǎn)。其中1例患者3個月內(nèi)連續(xù)檢測其抗體滴度，顯示依次為61BU→53BU→44BU下降趨勢，病情也有所緩解。本研究對輸注Ⅷ因子的血友病A患者進行抑制物作定性定量檢測，能盡早發(fā)現(xiàn)患者抗體的產(chǎn)生，有助于臨床對該疾病的早診斷、早治療和預(yù)后判斷。

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