液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中的黃曲霉毒素

鄭 燕，王遠(yuǎn)興*，李瑾瑾

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測食品中的黃曲霉毒素

鄭 燕，王遠(yuǎn)興*，李瑾瑾

(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

為提高黃曲霉毒素的檢測靈敏度，建立快速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法對食品中的4種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2進(jìn)行定性定量分析。樣品粉碎后用體積比為84:16的乙腈-水混合液提取，過濾后通過真菌毒素凈化柱進(jìn)樣，采用C18柱分離，0.1%甲酸溶液和甲醇做流動(dòng)相，以60:40比例等度洗脫，質(zhì)譜在多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)的正離子模式下進(jìn)行分析。4種組分在5min內(nèi)完全分離，而且此方法線性關(guān)系良好，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢出限分別是0.012、0.009、0.013、0.007μg/kg，平均加標(biāo)回收率在80%～95%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。該方法快速靈敏、準(zhǔn)確可靠，其檢出限可滿足歐盟地區(qū)嚴(yán)格的黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)。

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜；黃曲霉毒素；食品

黃曲霉毒素(aflatoxins，AFT)是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌代謝產(chǎn)生的一類有毒的真菌毒素[1-2]，廣泛存在于各種食品、農(nóng)產(chǎn)品和飼料中，嚴(yán)重污染著花生、玉米、大米、小麥等糧油產(chǎn)品，甚至堅(jiān)果、乳制品、酒類和調(diào)味品等一些常見食品中也能經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有黃曲霉毒素[3-4]。

黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，在自然界分布最廣的是B1、B2、G1、G2這4種，它們的基本結(jié)構(gòu)是由一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)?香豆素)組成，前者為基本的毒素結(jié)構(gòu)，后者與致癌性有關(guān)，并加強(qiáng)了前者的毒性[5-7]。

黃曲霉毒素是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，在所有的真菌毒素中，其毒性、致癌性、致突變性、致畸性均居首位，是目前已知致癌物中致癌力最強(qiáng)的一種[8-9]。黃曲霉毒素不僅毒性大、分布廣，而且結(jié)構(gòu)也比較穩(wěn)定，一般在食物的熱加工過程中都不易被破壞[10-11]，因此給消費(fèi)者的飲食安全埋下了巨大隱患。

鑒于黃曲霉毒素對人體健康危害巨大，世界各國政府及相關(guān)組織紛紛制定了食品中黃曲霉毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)和相應(yīng)的檢測方法。目前檢測黃曲霉毒素的常規(guī)方法主要有薄層色譜法、高效液相法、酶聯(lián)免疫吸附法[12-13]。但薄層色譜法操作步驟繁瑣、靈敏度低，而且有機(jī)試劑用量大、污染嚴(yán)重；高效液相色譜法通常使用熒光檢測器，需要將樣品在柱前或柱后進(jìn)行衍生，分析時(shí)間較長；酶聯(lián)免疫吸附法雖然前處理過程簡單，但有時(shí)易出現(xiàn)假陽性，造成定性結(jié)果有一定偏差[14-16]。

近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在食品安全領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，它將色譜的高效分離能力和質(zhì)譜的高靈敏度這兩種優(yōu)勢結(jié)合在一起，可以對很多種類的化合物進(jìn)行定性定量分析。林建忠[17]和楊靜[18]等分別采用了LC-MS/MS測定食品中的AFB1，張浩等[19]用LC-MS測定了花生中的4種AFT，但卻鮮見用二級質(zhì)譜對黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2同時(shí)檢測的報(bào)道。所以液質(zhì)聯(lián)用法在分析黃曲霉毒素方面還有較大的提升空間。本研究擬采用先進(jìn)的快速液相色譜串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)，使4種目標(biāo)化合物高效分離后，能夠準(zhǔn)確的定性定量，建立一種能夠同時(shí)分析黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生、玉米、芝麻、花生核桃乳飲品、燕麥片市購。黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(B1、G1質(zhì)量濃度均為1μg/mL，B2、G2質(zhì)量濃度均為0.3μg/mL) 美國Sigma公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)；甲酸(分析純)；超純水 實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 儀器與設(shè)備

6430三重四極桿液質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)[配有1200高效液相色譜系統(tǒng)、電噴霧離子源(ESI)及MassHunter數(shù)據(jù)處理軟件] 美國Agilent公司；Mycosep 226真菌毒素凈化柱 美國Romer公司；FA1104電子天平 上海精天電子儀器廠；KQ2200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；Milli-Q超純水儀 Millipore公司。

1.3 儀器參數(shù)

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱(4.6mm× 50mm，1.8μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸溶液-甲醇(60:40)；流速：0.4mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：5μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

表1 各種黃曲霉毒素的MRM掃描參數(shù)Table 1 Parameters for four kinds of aflatoxins in MRM

離子源：電噴霧離子源(ESI)；干燥氣流速：12mL/ min；干燥氣溫度：350℃；霧化氣壓力：50psi；毛細(xì)管電壓：4000V；質(zhì)量掃描范圍(m/z)：100～500；掃描模式：正離子模式；4種黃曲霉毒素的MRM掃描參數(shù)見表1。

1.4 樣品處理

稱取25g粉碎好的樣品置于250mL錐形瓶中，加入100mL乙腈-水溶液(84:16，V/V)，高速攪拌3min，用定性濾紙過濾，將濾液通過Mycosep 226真菌毒素凈化柱，收集凈化液。取1.5mL凈化液，過0.22μm濾膜，放入進(jìn)樣瓶中，待進(jìn)樣。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限

將標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成幾個(gè)不同濃度，按濃度由低到高的順序進(jìn)樣，在選定的色譜條件和質(zhì)譜條件下測定，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到4種黃曲霉毒素的線性方程和相關(guān)系數(shù)。計(jì)算3倍信噪比和10倍信噪比時(shí)所對應(yīng)的樣品濃度，分別作為方法的檢出限和定量限。

1.6 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

將每種樣品連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，測得各組分的峰面積，計(jì)算其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，來衡量方法的精密度。為考察該方法的準(zhǔn)確性，將每種樣品取3份，分別添加不同體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4節(jié)進(jìn)行樣品前處理，在1.3.1節(jié)的色譜條件和1.3.2節(jié)的質(zhì)譜條件下測定，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

由于黃曲霉毒素易溶于甲醇和乙腈，因此先后選用了甲醇、乙腈與水混合做流動(dòng)相。對于液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)來說，流動(dòng)相的選擇不僅要考慮對組分的洗脫能力，而且還需考慮在質(zhì)譜中是否能促使樣品達(dá)到較高的離子化效率[18]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，雖然乙腈在液相中的洗脫效果稍強(qiáng)于甲醇，但是用乙腈做流動(dòng)相時(shí)的離子豐度明顯降低，說明乙腈的離子化效率低，所以采用了甲醇作為流動(dòng)相。為了促進(jìn)樣品的離子化，本實(shí)驗(yàn)先后在流動(dòng)相中分別加入了0.1%甲酸、0.1%乙酸和10mmol/L乙酸銨，結(jié)果表明加入甲酸時(shí)的離子豐度最強(qiáng)，因此最終確定在純水中添加0.1%甲酸以增強(qiáng)離子化效果。

此外還考察了甲醇與水的比例對分析結(jié)果的影響。當(dāng)甲醇與水的比例大于40:60時(shí)，4種黃曲霉毒素不能完全分離，這樣會(huì)導(dǎo)致不同離子的離子化相互抑制，降低了靈敏度，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性；而水的比例較大時(shí)，出峰時(shí)間就會(huì)延長。結(jié)果表明，當(dāng)甲醇與水相的比例為40:60時(shí)，4種黃曲霉素G2、G1、B2、B1在5min內(nèi)先后出峰，并得到了最佳的分離效果，其MRM模式的總離子流圖見圖1(圖中1、2、3、4分別表示黃曲霉毒素G2、G1、B2、B1)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的MRM總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograph of AFT in the standard solution by MRM

2.2 質(zhì)譜條件的選擇

黃曲霉毒素是中等極性的物質(zhì)，所以適合用電噴霧離子源進(jìn)行離子化。實(shí)驗(yàn)中嘗試了分別采用正、負(fù)兩種離子模式，發(fā)現(xiàn)正離子模式下的離子化效率明顯高于負(fù)離子模式。在全掃描模式下，確定了M＋H作為4種黃曲霉毒素的母離子。子離子掃描時(shí)，選擇豐度高而且穩(wěn)定的離子做定量離子，最終確定了質(zhì)荷比(m/z)為241、259、243、245的這4個(gè)離子分別做B1、B2、G1、G2的定量離子，然后在選擇性離子掃描(SIM)和MRM模式下分別優(yōu)化裂解電壓和碰撞能，結(jié)果見表1。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

取不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3節(jié)中的色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)樣，以峰面積(y)對含量(x)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)，并根據(jù)3倍和10倍信噪比計(jì)算檢出限和定量限，結(jié)果見表2。

表2 線性方程、線性范圍及檢出限Table 2 Linear regression equations, linear ranges and detection limits of aflatoxins

2.4 精密度和回收率

按照1.6節(jié)方法進(jìn)行精密度和回收率實(shí)驗(yàn)，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率。精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3，RSD值均小于5%；表4是花生樣品的回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其他幾種樣品的回收率也都在80%～95%，各項(xiàng)數(shù)據(jù)表明該方法的精密度和回收率都比較良好。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Precision test of this analytical method for detecting AFT B1, B2, G1and G2

表4 花生樣品的加標(biāo)回收率Table 4 Recovery rates of AFT B1, B2, G1 and G2 in peanut samples

2.5 實(shí)際樣品的檢測

從市場采購了花生、玉米、芝麻、花生核桃乳飲料、燕麥片這5種食品，每種采購3批，然后按照1.4節(jié)方法進(jìn)行樣品前處理，在1.3節(jié)儀器條件下測定樣品中黃曲霉毒素的含量。分析結(jié)果顯示，花生和玉米中的黃曲霉毒素含量最高，其中一批玉米樣品的黃曲霉毒素總量(黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2含量之和)高達(dá)30μg/kg，而且AFB1占有很高的比例；芝麻中有兩批樣品含1μg/kg的AFB1；而花生核桃乳飲料和燕麥片中未檢出黃曲霉毒素。同時(shí)采用國標(biāo)中的高效液相色譜法進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)用液質(zhì)方法檢測出含有黃曲霉毒素的樣品在高效液相色譜這種傳統(tǒng)方法中卻未能檢出，說明新方法的靈敏度明顯優(yōu)于高效液相色譜法。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了快速液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法檢測多種食品中的4種黃曲霉毒素，用甲醇與水等度洗脫，在質(zhì)譜的正離子模式下監(jiān)測，5min內(nèi)4個(gè)組分完全分離，黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢出限可分別達(dá)到0.012、0.009、0.013、0.007μg/kg，不僅能滿足我國國標(biāo)GB 2761—2005《食品中真菌毒素限量》中黃曲霉毒素的限量要求(規(guī)定花生、玉米及其制品中的AFB1不得超過20μg/kg)，而且還能達(dá)到歐盟的嚴(yán)格限量標(biāo)準(zhǔn)(規(guī)定直接供人食用的花生、堅(jiān)果及其制品中AFB1含量不超過2μg/kg，AFT總量不超過4μg/kg)。該方法靈敏度高、準(zhǔn)確性好，而且簡單快速、能在短時(shí)間內(nèi)檢測大量樣品，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

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Determination of Aflatoxins in Food by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHENG Yan，WANG Yuan-xing*，LI Jin-jin
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)

In order to improve detection sensitivity of aflatoxions, a liquid chromatography-tandem mass spectrometry method was established for the simultaneously qualitative and quantitative analysis of aflatoxins B1, B2, G1and G2. Samples were sequentially extracted by acetonitrile-water at a ratio of 84:16 (V/V), cleaned up with multifunctional cleaning column. After injection, the chromatographic separation was achieved on a C18 column using a mobile phase composed of a mixture of 0.1% formic acid and methanol through gradient elution. The analysis was realized by multiple reaction-monitoring modes. Under above conditions, aflatoxins B1, B2, G1and G2could be completely separated in 5 min with an excellent linear relationship. The determination limits for 4 kinds of aflatoxins were 0.012, 0.009, 0.013μg/kg and 0.007μg/kg, respectively. The recovery rate of spiked samples was in the range of 80%-95% with a relative standard deviation less than 5%. This method can provide a rapid, sensitive, accurate and reproducible detection for aflatoxins and its detection limit is sensitive enough to meet the European regulation for aflatoxins.

liquid chromatography-tandem mass spectrometry；aflatoxins；food

TS207.3

A

1002-6630(2010)24-0385-04

2010-06-30

食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索資助課題(SKLF-TS-200915)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21045006)

鄭燕(1984—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)學(xué)。E-mail：fairy0003@163.com

*通信作者：王遠(yuǎn)興(1964—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全、食品化學(xué)。E-mail：yuanxingwang@ncu.edu.cn