固相美拉德反應增香法制備蝦風味料工藝及SPME-GC-MS測定

解萬翠，楊錫洪*，陳昊林，章超樺，吉宏武

(水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點實驗室，廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088)

固相美拉德反應增香法制備蝦風味料工藝及SPME-GC-MS測定

解萬翠，楊錫洪*，陳昊林，章超樺，吉宏武

(水產(chǎn)品深加工廣東省普通高校重點實驗室，廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524088)

為提高對蝦副產(chǎn)品深加工利用水平，以南美白對蝦蝦頭酶解蛋白粉為原料，采用微波加熱實驗設備，以感官品評為指標，研究影響低水分含量的固相原料美拉德反應增香效果的各因素，并通過單因素試驗以及響應面法優(yōu)化最佳條件。結果表明：將蝦頭酶解液pH值調整為6.9，進行干燥處理，制備蝦頭酶解蛋白粉；添加增香劑，其中還原糖5%、氨基酸2%、?；撬?.3%；通過響應面優(yōu)化的微波加熱最佳工藝條件：反應時間2min、起始水分含量30%，得到的蝦風味料蝦味濃郁；產(chǎn)品經(jīng)SPME-GC-MS檢測，共鑒定出69種風味成分，主要有吡嗪類、酮類、醇類、醛類、嘧啶和有機酸等化合物。其中吡嗪類物質占揮發(fā)性成分相對含量49.86%，在產(chǎn)品香氣中起主導作用。本實驗所得最佳工藝不但可以提高對蝦副產(chǎn)品的深加工利用，同時為復合調味料的生產(chǎn)開拓了新的領域。

蝦頭酶解物；微波加熱；美拉德反應；風味基料；固相微萃取；氣相色譜-質譜聯(lián)用

蝦頭是對蝦加工的副產(chǎn)品，占蝦體質量的30%～40%[1]，目前對于蝦頭的綜合利用主要有提取蝦青素、甲殼素、殼聚糖，生產(chǎn)飼料以及制備蛋白水解物等。蝦頭蛋白水解后產(chǎn)生豐富的氨基酸、肽及可溶性蛋白，具有增加營養(yǎng)價值、提高功能特性以及具有潛在的生物活性等特點，因此利用蝦副產(chǎn)品制備水解蛋白已經(jīng)在食品工業(yè)中得到廣泛應用。

由于蝦頭中還含有腦磷脂、卵磷脂、類胡蘿卜素、碳水化合物、維生素等營養(yǎng)成分，鈣、磷、鐵、鋅等微量元素以及?；撬?、生理活性肽、核苷酸等活性成分[2]，因此，利用低值蝦頭生產(chǎn)高質量天然海鮮調味品可極大提高產(chǎn)品的附加值。依據(jù)近年來調味品行業(yè)倡導的“味料同源”理念，以含有豐富的氨基酸，多肽等呈味物質及具有濃郁海鮮風味的水產(chǎn)下腳料制備風味基料并進行復配，生產(chǎn)新型海鮮復合調味品日漸受到消費者的喜愛并引起調味品行業(yè)的關注。

以往研究[3-6]主要集中在水相美拉德反應法生產(chǎn)蝦風味基料工藝的探索，即采用蝦頭酶解物，置于反應釜中進行熱反應，此法生產(chǎn)的調味基料生產(chǎn)成本較高，且產(chǎn)品為液體，且在后期的干燥中風味成分損失嚴重。本實驗先制備蝦頭酶解蛋白粉末，然后對酶解蛋白粉進行固相增香加工處理。以期在低水分含量的條件下運用新型加工工藝得到風味更優(yōu)的新型蝦風味基料，并通過感官品評和GC-MS結合的方法描述和分析固相增香產(chǎn)物的風味。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蝦頭：南美白對蝦(又名凡納濱對蝦)蝦頭，由廣東省湛江市亞洲水產(chǎn)有限公司提供。

葡萄糖、木糖、甘氨酸、精氨酸、牛磺酸(均為分析純) 天津市百世化工有限公司；風味酶(8萬U/g)、中性蛋白酶(12萬U/g) 南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

WG900型微波爐 格蘭仕日用電器有限公司；氣相色譜-質譜聯(lián)用儀 美國Finnigan公司；固相微萃取裝置(SPME)(PDMS 100μm) 美國Supelco公司。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

PEG 20M色譜柱(30m×0.25mm，0.25μm)；程序升溫，40℃保持2min，以6℃/min速度升至120℃，再以10℃/min升至250℃保持10min；載氣(He)流速0.8mL/ min，壓力2.4kPa，進樣量0.5μL；不分流進樣。

1.3.2 質譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度250℃；離子源溫度200℃；質量掃描范圍m/z 33～450，檢測器電壓350V。

1.4 蝦頭酶解蛋白粉制備

蝦頭清洗干凈，用打漿機破碎，得到蝦頭泥。對蝦頭泥進行預熱變性處理，在85℃恒溫水浴中保持攪拌10min。在蝦頭泥中按0.25g/100g添加量加入風味酶，按0.05g/100g加入中性蛋白酶，調節(jié)pH7，54℃水浴2h后85℃水浴滅酶10min，再調節(jié)體系pH值為7，制備出酶解蝦頭漿。酶解蝦頭漿經(jīng)過壓榨、過濾，轉移至噴霧干燥設備中進行噴霧干燥，得到蝦頭酶解蛋白粉。

1.5 微波加熱固相增香工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗

按照木糖:葡萄糖為1:4配制還原糖，甘氨酸:精氨酸為1:1配制氨基酸，然后研究還原糖添加量、氨基酸添加量、還原糖與氨基酸添加量比例、?；撬崽砑恿俊⒓訜釙r間、水分含量、起始pH值等因素的影響，并對反應產(chǎn)物進行感官品評[5]。

1.5.2 響應面設計優(yōu)化

基于單因素試驗結果，選擇加熱時間、初始水分含量、pH值三因素五水平的工藝參數(shù)進行中心組合試驗設計，反應產(chǎn)物用評分檢驗法進行感官評定，最后以感官評定所得的分數(shù)作為試驗指標。中心組合試驗因素見表1。

表1 中心組合試驗因素水平Table 1 Factors and levels of central composite experiments

1.6 感官品評

邀請十名熟悉蝦風味的專業(yè)人員，首先對感官品評方法進行解釋和培訓，取經(jīng)過沸水灼煮的蝦頭10～20個，搗碎后置于廣口容器中，讓感官品評員充分熟悉煮熟對蝦的香氣，做為純正熟蝦風味的參比，并對固相增香產(chǎn)品進行感官品評和評分。

品評時，將樣品用蒸餾水按1:50稀釋至同一濃度，隨機編號。設定甜味、苦味、咸味、鮮味、煮蝦香味、焦香味6個指標進行感官評定，把評價的強度結果用等距標度計分，以十分制轉化為數(shù)值。該感官評定所得數(shù)值作為實驗產(chǎn)品的感官指標。最后的評分結果取各項指標的的平均分乘以權重，再加和得出最終評分。感官評定標準及權重設置見表2。

表2 蝦風味的感官品評權重(HW)及評分標準Table 2 Heavy weights (HW) and standards of sensory evaluation for shrimp flavor

1.7 SPME-GC-MS對揮發(fā)性風味成分的檢測

萃取條件：萃取頭PDMS、厚度100μm、萃取溫度50℃、萃取時間30min。具體操作參照文獻[7]進行。

2 結果與分析

2.1 微波加熱固相美拉德反應單因素試驗

圖1 單因素試驗結果Fig.1 Results of single factor experiments

在微波作用下體系產(chǎn)生的熱效應可認為等同于常規(guī)加熱方法[8]。分析單因素試驗結果(圖1)，發(fā)現(xiàn)隨著還原糖添加量的增加，微波加熱固相增香的效果逐漸增強，添加量達到5%時，增香效果較好，產(chǎn)品蝦味明顯，并伴有適宜的燒烤香味。當添加量大于5%后，焦香味逐漸覆蓋蝦的鮮香味，但這種影響不明顯。隨著氨基酸添加量的增加，微波加熱增香的效果也相應地提高，當添加量到達6%時，增香效果最佳，海鮮風味濃郁，表明還原糖和氨基酸是美拉德反應生香的重要前體物質，但當氨基酸的添加量達到8%時，香氣中帶有輕微刺激性的揮發(fā)性氮氣味，添加量達到10%時，這種刺激性氣味更加濃烈，說明較多的氨基酸不能完全與還原糖發(fā)生羰胺反應，而是在加熱過程發(fā)生了降解。在還原糖與氨基酸總量為7%條件下，調整其比例，當相對比例在5:2時風味最佳，具有柔和醇厚的烤蝦香味和肉味。文獻資料關于美拉德反應動力學研究[9]顯示，葡萄糖與甘氨酸在不同的比例下發(fā)生美拉德反應生成產(chǎn)物有所不同，是由于該比例對分子重排反應的化學平衡有一定程度的影響作用。

本實驗添加?；撬徇M行反應，在0.3%添加量時獲得較好的香氣，但添加量大于0.4%后，產(chǎn)生了類似鐵腥味的不良風味。國外已有研究報道?；撬崾窃跓岱磻斨挟a(chǎn)生海鮮獨有鮮香味的重要氨基酸，當溫度高于100℃條件下，在甘氨酸存在的食品體系中，微量的?；撬峥梢种契０肺镔|的形成和降低褐變程度[10]，但對于?；撬岬脑鱿銠C理尚未有報道。

林業(yè)技術管理的關鍵不僅在于管理者對林業(yè)技術管理的專業(yè)知識，而且在于林業(yè)生產(chǎn)企業(yè)對管理知識的提升。有些企業(yè)沒有意識到管理知識的重要性，因此沒有在企業(yè)內部大力推廣管理知識。然而，推廣是不夠的。一方面，林業(yè)員工無法意識到森林管理技術的重要性，另一方面，他們無法豐富員工和管理人員的森林管理技術知識。認識到問題不能很快解決。這會給企業(yè)帶來損失，但也可能引起內部矛盾。

研究表明，美拉德反應的進行必須在食品中的水分大于等于10%，通常為15%以上。且在一定范圍內(10%～25%)，隨著水分含量的增加，分子擴散容易，美拉德反應速度也加快[11]。本實驗中隨著水分含量的增加，固相增香產(chǎn)品香氣的評分上升，當水分含量在30%時，香味評分最高，呈濃郁柔和的烤蝦香氣。當水分含量超過30%后，評分開始下降。

Maillard反應體系的初始pH值對揮發(fā)性物質的產(chǎn)生起著重要的影響作用。隨著反應體系起始pH值的升高，微波加熱Maillard反應增香效果越來越好，當起始pH值達到7時，增香作用最明顯，香氣柔和，蝦味和焦香味恰到好處，但超過pH7以后，Maillard反應產(chǎn)物風味急劇下降，尤其當pH值到達pH9時，揮發(fā)氣味帶有刺激性的不良風味，而且產(chǎn)物的顏色較黑。已有研究表明[12]，初始體系的pH值增加，羰胺反應產(chǎn)生的吡嗪類物質的種類和數(shù)量也增加，吡嗪是具有較強風味和氣味的一大類物質，對優(yōu)化食品風味起著重要作用。體系pH值對吡嗪類物質的產(chǎn)生有著決定性作用，因為羰基和氨基隨著體系氫離子濃度的變化進行不同程度的離子化，而這些基團的離子化對吡嗪物質生成的第一步是非常關鍵的。在酸性介質下熱反應的效果欠佳，這可能由于在酸性較強的介質中，氨基的反轉使美拉德反應的中間產(chǎn)物變得不活潑，從而得不到大量的芳香類物質。在堿性介質中，氨基酸呈陰離子態(tài)，此時氨基酸的反應性加強，羰氨縮合后，糖通過反醇醛、烯醇化和脫水反應進行降解。這些反應都具有堿催化作用，所以美拉德反應速率隨介質的pH值升高而增大。美拉德反應速度過快，會導致產(chǎn)生不良香氣的反應提前進行，呈現(xiàn)反應過度的狀態(tài)。同時由于焦糖化反應也加快，在低水分含量下溫度容易接近焦糖化反應而產(chǎn)生很多不愉快的風味。因此，pH值過高或者過低，都不利于風味物質的形成。

2.2 微波加熱固相美拉德反應條件優(yōu)化

根據(jù)感官品評標準評分，三因素五水平中心組合試驗結果見表3。

2.2.1 二次回歸模型擬合

根據(jù)表3的結果，以感官評分結果為響應值，運用design_expert 7.1.6(Response surface)程序，確定了回歸方程的系數(shù)，該試驗的回歸方程為：

表3 中心組合試驗感官品評結果Table 3 Sensory evaluation results of central composite experiments

2.2.2 數(shù)據(jù)分析

表4 方差分析Table 4 Variance analysis of central composite experiments

從表4可以看出，加熱時間(X1)、pH值(X3)對響應變量反應產(chǎn)物風味評分的影響顯著，水分含量(X2)對響應變量反應產(chǎn)物風味評分的影響不顯著，其原因可能在于水分含量水平之間的差異不大，反應體系中分子的活動自由程度差異也不大所致。

表5 各項誤差分析Table 5 Error analysis of each factor

響應變量的二次多項式模型的回歸系數(shù)如表5所示，各項系數(shù)經(jīng)t檢驗得加熱時間(X1)二次項和pH值(X3)二次項對反應產(chǎn)物的風味評分影響顯著；各因素之間的交叉項系數(shù)除加熱時間和pH值交叉項對風味評分為顯著以外，其他交互因素對風味評分的影響不顯著，說明各因素之間交互作用不明顯。

根據(jù)F值的大小以及對各回歸系數(shù)的分析，可以判定各試驗因素對響應值的的影響依次是：X1＞X3＞X2。即對響應變量反應產(chǎn)物風味評分的影響重要程度依次：加熱時間＞體系初始pH值＞水分含量。

2.2.3 回歸模型的響應面分析

圖2 微波加熱下固相增香反應的響應曲面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots for microwave-heating Maillard reaction

由圖2可知，隨著加熱時間的延長，感官品評綜合分值隨之增加，而隨著時間的繼續(xù)延長，感官品評綜合分值則緩慢降低，曲線較平緩；當水分含量較低時，感官品評綜合分值也較低，隨著水分含量的增加，感官品評綜合分值逐漸增加，但到達一定值后，再增加水分含量，感官品評綜合分值則緩慢降低。pH值對感官品評綜合分值的影響趨勢同加熱時間，隨著pH值的逐漸增加，感官品評綜合分值也逐漸增加，直到最佳pH值時，感官品評綜合分值最大，隨后，隨著pH值的增加，感官品評綜合分值則逐漸降低。感官品評綜合分值隨著水分含量的逐漸增加而緩慢增加，到達最大值后，即使水分含量繼續(xù)增加，感官品評綜合分值增加的很少。

對等高線的綜合分析可以看出，加熱時間是影響感官品評綜合分值的最顯著因素，表現(xiàn)為等高線較陡峭；體系初始pH值次之；水分含量對其影響最小，表現(xiàn)為等高曲線較為平滑。

2.2.4 固相增香最佳反應參數(shù)的求解

穩(wěn)定點的分析可用數(shù)學方法來求解。如果一個函數(shù)的穩(wěn)定點存在，它應該使其對每一個決定變量的偏導數(shù)分別為零，這樣可以聯(lián)立一個方程組，求出該穩(wěn)定點。

為了確定最佳點的值，對回歸方程取一階偏導等于零，去掉不顯著項，整理得方程組如下：

解方程組得，X1=0.2268、X2=-0.0054、X3=-0.1155。

利用此方法求出數(shù)學模型的穩(wěn)定點坐標為(0.2268，-0.0054，-0.1155)，穩(wěn)定點的坐標也即變換為(2.112，30%，6.885)，此時模型達到最大值，最大值為7.1分。也就是說適宜的加熱時間為2.1min，水分含量30%，pH6.9。該參數(shù)經(jīng)驗證實驗所得分數(shù)為7.3分，與模型理論最大值相近。

2.3GC-MS測定結果

圖3 微波加熱固相增香產(chǎn)品的揮發(fā)性成分總離子流色譜圖Fig.3 Total ion current chromatogram of volatile components in microwave-heating Maillard reaction products

通過SPME-GC-MS測定，微波加熱固相增香產(chǎn)物揮發(fā)性化合物的總離子流圖如圖3所示，微波加熱下的美拉德反應增香制備的蝦香味料的GC-MS鑒定結果及含量如表6所示。

由表6可見，蝦風味成分主要由吡嗪、酮、醇、醛、嘧啶、有機酸等化合物組成，其中吡嗪類物質的相對含量高達49.86%，并以3-乙基-2,5-二乙基-吡嗪的相對含量最高，達11.86%。說明吡嗪類物質是對蝦頭酶解蛋白固相增香產(chǎn)品風味貢獻最大的物質，據(jù)文獻報道，吡嗪類物質是熟對蝦，煮小龍蝦，烤蝦的風味成分的主要貢獻物質[13]，具有特殊的海鮮肉氣味、烤香、果仁[14]的特征香氣。其次為醛類物質，相對含量達18.87%，其中以4-辛基-苯甲醛的相對含量最高，達12.87%。醇類物質占8.98%，主要物質為1-(2-丁氧基乙氧基)-乙醇；酮類占7.45%，主要物質為1-羥基-2-丙酮。有機酸使其具有淡甜柔和的氣味，酯類則可提高和改善其香味，其他物質如吡咯、呋喃、酯等有機化合物也對風味起著重要的貢獻[15]。它們共同構成了產(chǎn)品的風味特征，使產(chǎn)品具有強烈的海鮮特征氣味。

表6 微波加熱固相增香產(chǎn)物的GC-MS鑒定結果及含量Table 6 Identification and contents of microwave-heating Maillard reaction products by GC-MS

續(xù)表6

3 結 論

3.1 通過單因素和響應面試驗設計優(yōu)化確定各因素對產(chǎn)物風味影響的大小順序：反應時間＞水分含量＞pH值。微波加熱Maillard反應的最佳條件：還原糖添加量5%、氨基酸添加量2%、牛磺酸添加量0.3%、反應時間2min、水分含量30%、起始pH6.9。

3.2 微波固相加熱增香產(chǎn)品中含有豐富的揮發(fā)性化合物，對于其特征性的香氣有重要的作用。首先由感官品評得到風味良好的蝦調味料，然后經(jīng)GC-MS檢測其揮發(fā)性風味成分，分析結果表明吡嗪類物質占揮發(fā)性成分相對含量的49.86%，具有烤肉和果仁香氣，對于增香產(chǎn)品的香氣貢獻是最大的。

3.3 通過工藝優(yōu)化，以蝦頭酶解蛋白粉為原料，所制備的蝦風味基料除保留原有的海鮮風味和特色外，香味更加濃郁，本實驗所得最佳工藝不但可以提高對蝦副產(chǎn)品的深加工利用，同時為復合調味料的生產(chǎn)開拓了新的領域。

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Preparation Processing of Shrimp Flavorings by Microwave-heating Maillard Reaction Method and Determination of Volatile Aroma Compounds

XIE Wan-cui，YANG Xi-hong*，CHEN Hao-lin，ZHANG Chao-hua，JI Hong-wu
(Key Laboratory of Aquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher Education Institutes, College of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang 524088, China)

In order to improve the depth development and utilization of shrimp by-products, the hydrolysate powder of Penaeus vanamei shrimphead was used as raw material to conduct microwave-heating treatments. Based on the single factor experimental results, the optimal preparation processing was explored by response surface experiments using sensory evaluation as the index. Results indicated that the optimal enzymatic hydrolysis processing were enzymatic hydrolysis pH of 6.9, reducing sugar of 5%, amino acids of 2% and taurine of 0.3%. Meanwhile, the optimal microwave-heating processing parameters were reaction time of 2 min and initial water content of 30%. Under these optimal processing conditions, prepared shrimp flavorings exhibited strong aromatic flavor. A total of 69 volatile flavor components were detected in prepared products by SPME-GC-MS, which included pyrazines, ketones, alcohols, aldehydes, and organic acids. Moreover, the pyrazines was accounted for 49.86% of total volatile components and exhibited a significant contribution to product aroma. These investigations not only improve the depth exploitation and utilization of shrimp by-products, but also provide a new area for the development of compound seasonings.

shrimphead hydrolysate；microwave-heating；Maillard reaction；flavorings；SPME-GC-MS

TS254.9

A

1002-6630(2010)24-0199-07

2010-06-30

“十一五”國家科技支撐計劃項目(2007BAD29B09；2008BAD94B08)

解萬翠(1969—)，女，副教授，博士，研究方向為食品風味和食品質量與安全。E-mail：xiewancui@163.com

*通信作者：楊錫洪(1963—)，男，副教授，博士，研究方向為食品添加劑。E-mail：yangxihong63@163.com