鄰二氮菲-Fe2+法測(cè)定保健食品的抗氧化能力

劉 薇，王宏君，趙 建，文 悅，文 鏡*

(生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191)

鄰二氮菲-Fe2+法測(cè)定保健食品的抗氧化能力

劉 薇，王宏君，趙 建，文 悅，文 鏡*

(生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191)

目的：用鄰二氮菲-Fe2+法測(cè)定保健食品抗氧化能力。方法：以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)參照物，通過(guò)單因素分析，確定試劑用量及反應(yīng)時(shí)間對(duì)線性關(guān)系、最低檢測(cè)限、平行性精密度、重復(fù)性精密度、加標(biāo)回收率等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：Trolox在質(zhì)量濃度0.01～0.15g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；最低檢測(cè)下限為0.0050g/L；平行性精密度為(375±12)μmol/g，變異系數(shù)3.2%；重復(fù)性精密度為(365±16)μmol/g，變異系數(shù)4.4%；5次重復(fù)加標(biāo)回收率為(98.0±2.4)%。結(jié)論：改良的鄰二氮菲-Fe2+法適用于保健食品抗氧化能力的檢測(cè)。

保健食品；抗氧化能力；鄰二氮菲-Fe2+法

多項(xiàng)研究證明衰老以及多種疾病的發(fā)生過(guò)程都與活性氧有關(guān)。因此，與健康關(guān)系密切的食品，特別是功能性食品抗氧化能力的測(cè)定，以及對(duì)生物體內(nèi)抗氧化水平的分析引起了人們的廣泛關(guān)注[1-5]。功能性食品抗氧化能力的體外測(cè)定方法相對(duì)于體內(nèi)測(cè)定方法簡(jiǎn)便、快捷、成本低、人員不需特別訓(xùn)練，適用于對(duì)大批量材料的篩選、抗氧化保健食品市場(chǎng)監(jiān)督以及在保健食品抗氧化功能評(píng)價(jià)中作為體內(nèi)評(píng)價(jià)結(jié)果的旁證[6-7]。體外測(cè)定抗氧化物質(zhì)清除自由基的方法主要包括化學(xué)發(fā)光法、分光光度法、電子自旋共振法、電化學(xué)檢測(cè)法、氣相色譜法和熒光法等[8-13]。鄰二氮菲-Fe2+法屬于分光光度法，最初是利用鄰二氮菲可與Fe2+生成橙紅色有色物而用于檢測(cè)樣品中Fe2+的方法[14-15]。由于Fenton反應(yīng)[16]產(chǎn)生的羥自由基能夠氧化反應(yīng)體系中的Fe2+，由此出現(xiàn)了用于檢測(cè)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基的鄰二氮菲-Fe2+氧化法，雖然此方法對(duì)反應(yīng)條件的要求較高，影響因素較復(fù)雜，但由于所需設(shè)備簡(jiǎn)單、試劑便宜、操作簡(jiǎn)便，此方法還是得到了較為廣泛的應(yīng)用[17]。但由于原方法是針對(duì)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基的檢測(cè)方法，如果將其應(yīng)用于對(duì)保健食品的檢測(cè)就會(huì)出現(xiàn)方法線性范圍窄、最低檢測(cè)限高、穩(wěn)定性差、結(jié)果表達(dá)方式缺乏可比性等不足。目前，對(duì)于樣品抗氧化值的表示方法上不同文獻(xiàn)有著各自的表示方法，如：抗氧化劑對(duì)羥自由基的清除率表示法[18]、酶活力值表示法[19]，雖然這些也能準(zhǔn)確的反應(yīng)抗氧化劑的能力強(qiáng)弱，但如若不同方法有著各自不同的表示抗氧化強(qiáng)弱的表示，那最終檢測(cè)出的數(shù)據(jù)也就沒有了

可比性。本實(shí)驗(yàn)主要研究鄰二氮菲-Fe2+法的反應(yīng)條件及反應(yīng)體系，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的改良來(lái)彌補(bǔ)原方法的不足，在方法改良過(guò)程中將對(duì)影響檢測(cè)的各種因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，確定最佳實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)方法的可行性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定。最終達(dá)到提高方法穩(wěn)定性、擴(kuò)大線性范圍、降低最低檢測(cè)限、使測(cè)定結(jié)果具有可比性、適用于保健食品抗氧化能力體外檢測(cè)的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山竹粉、捯捻子素、紅曲粉 義烏章舸生物工程有限公司；葡萄籽膠囊 艾申特生物科技有限公司；保健食品(品名：健康啟程) 北京北衛(wèi)藥業(yè)有限責(zé)任公司。

六水合硫酸亞鐵(Ⅱ)銨(硫酸亞鐵銨)、1,10-鄰二氮菲、檸檬酸、檸檬酸鈉、磷酸、丙酮、環(huán)己烷、乙醇、30%雙氧水(均為國(guó)產(chǎn)分析純)；抗壞血酸、水溶性VE(Trolox) Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；PP-15專業(yè)型pH計(jì)、P211D 分析天平 北京賽多利斯有限公司；渦旋混勻器 德國(guó)IKA公司；KQ-100B臺(tái)式超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置(EYELA N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，EYELA SB-2000水浴鍋，SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵) 上海愛明儀器有限公司；UV-2450 紫外-可見分光光度計(jì) 日本Shimadzu公司；METTLER AE100電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HS-4IKA WERKE C-MAG加熱磁力攪拌器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；TDL-5CENTRIFUGE離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

Fe2+與鄰二氮菲能夠生成穩(wěn)定的橙紅色絡(luò)合物在536nm波長(zhǎng)有最大吸收峰。反應(yīng)體系中定量加入的Fe2+和H2O2通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基。自由基和氧化劑將一部分Fe2+氧化為Fe3+，使橙紅色絡(luò)合物減少。體系中加入抗氧化劑與體系中自由基和氧化劑反應(yīng)，使Fe2+的減少受到抑制。用分光光度計(jì)測(cè)定橙紅色絡(luò)合物吸光度的變化即可知道抗氧化劑抗氧化能力的高低。以水溶性VE在反應(yīng)體系中的抗氧化能力作為標(biāo)準(zhǔn)，以單位質(zhì)量樣品的抗氧化能力相當(dāng)于多少水溶性VE來(lái)反映被測(cè)樣品的抗氧化能力。

1.3.2 試劑配制

按常規(guī)方法配制：檸檬酸緩沖液(0.1mol/L、pH4.4)、六水合硫酸亞鐵胺溶液(6mmol/L)、鄰二氮菲溶液(6mmol/L)、雙氧水(0.1%)、Trolox標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(0.2g/L Trolox)。

1.3.3 樣品的提取

精確稱取樣品(山竹粉0.01g、捯捻子素0.05g、葡萄籽膠囊0.1g、健康啟程0.3g、紅曲粉0.5g等)用30mL去離子水溶解后，超聲提取30min，3000r/min離心10min，將上清液移入100mL容量瓶?jī)?nèi)，沉淀用50mL去離子水溶解后再提取一次，合并兩次提取液，用去離子水定容至100mL搖勻，即為待測(cè)樣品。

1.3.4 測(cè)定方法

1.3.4.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

根據(jù)反應(yīng)機(jī)理調(diào)整反應(yīng)體系中主要試劑用量及反應(yīng)時(shí)間，采用單因素分析進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，探索最佳實(shí)驗(yàn)條件。

1.3.4.2 樣品及Trolox的測(cè)定方法

按照表1所列順序依次向試管中加入試劑并按表中規(guī)定的條件操作。

表1 樣品及Trolox的測(cè)定方法Table 1 Reagent composition for antioxidant capacity assessment by phenanthroline- Fe2+method using trolox as the reference substance

每管加入鄰二氮菲后應(yīng)立即混勻，否則會(huì)影響重復(fù)性。

1.3.4.3 抗氧化能力值的計(jì)算

抗氧化能力值=[(A樣品－A樣品空白－A損傷)/(ATrolox－A損傷)]× [mTrolox/m樣品] (1)

抗氧化能力值以Trolox當(dāng)量(μmol Trolox當(dāng)量/g)表示，即1g樣品相當(dāng)于Trolox的μmol數(shù)。式中：A樣品為樣品管吸光度；A樣品空白為樣品空白管吸光度；ATrolox為標(biāo)準(zhǔn)管吸光度；A損傷為損傷管吸光度。mTrolox為標(biāo)準(zhǔn)管所含Trolox的μmol數(shù)；m樣品為標(biāo)準(zhǔn)管所含樣品的質(zhì)量。

1.3.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將0.2g/L Trolox標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別取0.1、0.25、0.5、1.0、1.5mL于試管中，再分別加入1.9、1.75、1.5、1、0.5mL的去離子水，配成質(zhì)量濃度為0.01、0.025、

0.05、0.1、0.15g/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品溶液。按表1測(cè)定。

1.3.4.5 最低檢測(cè)下限

連續(xù)測(cè)定損傷管吸光度10次，按式(2)計(jì)算結(jié)果。

式中：D.L為最低檢測(cè)限；s為標(biāo)準(zhǔn)偏差；K為斜率。

1.3.4.6 平行性精密度實(shí)驗(yàn)

精確稱取山竹粉0.01g五份，平行操作，用1.3.3節(jié)的方法提取后，按表1方法測(cè)定。按式(1)計(jì)算。

1.3.4.7 重復(fù)性精密度實(shí)驗(yàn)

取山竹粉前處理方法同上，每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定5d。按式(1)計(jì)算。

1.3.4.8 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精確稱取0.1000g葡萄籽提取物2份，其中一份定量加入0.0050g標(biāo)準(zhǔn)Trolox，樣品處理及測(cè)定方法同上。重復(fù)測(cè)定5次。按式(1)、(3)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.1.1 H2O2用量的選擇

表2 H2O2用量選擇實(shí)驗(yàn)Table 2 Effect of hydrogen peroxide concentration

經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，H2O2加量為0.05mL時(shí)，最低檢測(cè)限最小，檢測(cè)范圍最寬。H2O2加量過(guò)少，自由基產(chǎn)生的不夠，檢測(cè)范圍較窄；H2O2加量過(guò)多，過(guò)量的H2O2與樣品中還原性物質(zhì)反應(yīng)，還原性物質(zhì)對(duì)Fe2+保護(hù)的靈敏性下降，使得檢測(cè)下限偏高。

2.1.2 顯色時(shí)間的選擇

表3 顯色時(shí)間選擇實(shí)驗(yàn)Table 3 Effect of color development time

經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水浴50min為H2O2產(chǎn)生自由基的最佳反應(yīng)時(shí)間。水浴時(shí)間不足，自由基產(chǎn)生的不夠，會(huì)使得線性范圍較窄；水浴時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使得更多的Fe2+被H2O2氧化成Fe3+，F(xiàn)e3+過(guò)多會(huì)干擾到Fe2+的顏色，因此線性關(guān)系不好。改變顯色時(shí)間主要是為了擴(kuò)大線性范圍。如果損傷時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，低濃度的抗氧化成分不足以產(chǎn)生作用，造成最低檢測(cè)下限有所升高。由此可見反應(yīng)時(shí)間對(duì)線性范圍和最低檢測(cè)下限都有影響。為了達(dá)到擴(kuò)大線性范圍和降低檢測(cè)下限的目的，就要衡量二者，使結(jié)果達(dá)到最佳。

2.1.3 溶劑的選擇

由于此反應(yīng)是離子間的氧化還原反應(yīng)，離子越多實(shí)驗(yàn)的干擾因素也會(huì)隨之增多，因此溶劑應(yīng)選擇去離子水。

2.1.4pH值的選擇

在堿性條件下Fe2+容易和體系中的氫氧根離子形成絮狀沉淀，影響比色，所以選擇了pH4.4的酸性體系，消除了沉淀干擾。

2.1.5 二價(jià)鐵試劑的選擇

由于Fe2+不穩(wěn)定，因此選用和銨根離子結(jié)合的硫酸亞鐵銨，穩(wěn)定性相對(duì)有所提高。但使用時(shí)最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.1.6 反應(yīng)溫度的選擇

為了使反應(yīng)充分迅速，選用了37℃的水浴條件，但測(cè)定時(shí)為了減少各管之間存在的反應(yīng)時(shí)間差，各平行管應(yīng)同時(shí)進(jìn)出水浴鍋，取出時(shí)應(yīng)立即將試管放入冰水浴中，讓37℃反應(yīng)立刻終止，然后再拿去比色。

2.2Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Trolox standard curve

應(yīng)用改良后的方法經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：Trolox在質(zhì)量濃度0.01～0.15g/L范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系和較低的檢測(cè)下限。

2.3 最低檢測(cè)下限實(shí)驗(yàn)

平行測(cè)定10次損傷值，結(jié)果見表4。

表4 最低檢測(cè)下限實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Determination of limit of detection

由式(2)計(jì)算可得，D.L=3s/K=3×0.006346/3.849= 0.0050g/L。

改良方法測(cè)得的結(jié)果顯示，最低檢測(cè)下限為0.0050g/L。雖然實(shí)驗(yàn)測(cè)得的值為0.0050g/L，但在實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)，樣品濃度要稍高一些，否則測(cè)定結(jié)果不明顯。

2.4 平行性精密度實(shí)驗(yàn)

表5 平行性精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Relative standard deviation of the method in 5 parallel determinations

用山竹粉進(jìn)行平行性精密度實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果為(375± 12)μmol/g，變異系數(shù)為3.2%，表明方法的平行性精密度良好。

2.5 重復(fù)性精密度實(shí)驗(yàn)

表6 重復(fù)性精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 6 Relative standard deviation of the method in 5 repeated determinations

用山竹粉進(jìn)行重復(fù)性精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為(365±16) μmol/g，變異系數(shù)為4.4%，表明方法的重復(fù)性精密度良好。

2.6 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

表7 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Spike recoveries of the method

用葡萄籽提取物進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，5次重復(fù)結(jié)果為(98.0±2.4)%，表明方法具有較好的準(zhǔn)確度。2.75種樣品抗氧化能力的測(cè)定

用改良方法順利測(cè)定了山竹粉等5種樣品的抗氧化能力，結(jié)果見表8。

表8 樣品抗氧化能力測(cè)定結(jié)果(n=5)Table 8 Antioxidant capacity of some samples using the method

3 討 論

3.1 方法的穩(wěn)定性

用鄰二氮菲-Fe2+法測(cè)定保健食品抗氧化能力，由于自由基是通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的，自由基產(chǎn)生量與H2O2有密切關(guān)系，反應(yīng)體系中除了自由基和樣品反應(yīng)外，氧化劑也會(huì)直接參與反應(yīng)。所以影響體系最終顯色反應(yīng)的因素較為復(fù)雜。只有控制好體系自由基的產(chǎn)生量才能使反應(yīng)在檢測(cè)樣品抗氧化能力過(guò)程中穩(wěn)定、靈敏并且有較寬的檢測(cè)范圍。因此需要對(duì)影響顯色反應(yīng)的主要因素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。通過(guò)對(duì)主要影響因素的選擇實(shí)驗(yàn)，改良后方法的穩(wěn)定性、靈敏度和檢測(cè)范圍都得到了提高。

3.2 掩蔽干擾顯色的離子

反應(yīng)中Fe2+會(huì)被H2O2氧化為Fe3+，當(dāng)Fe2+和Fe3+共存情況下，F(xiàn)e3+的干擾是客觀存在且不可忽視的。在酸性條件下Fe3+與H3PO4形成穩(wěn)定的無(wú)色Fe(HPO4)+配離子，從而有效地排除了Fe3+對(duì)Fe2+離子測(cè)定的干擾。H3PO4不具有氧化性，測(cè)定時(shí)不參與對(duì)Fe2+離子的氧化作用。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品的處理

Trolox雖然可以溶于緩沖液中，但溶解困難。因此用磁力攪拌器50℃混勻攪拌溶解不會(huì)對(duì)Trolox的還原性造成傷害。如果用二甲基亞砜溶解Trolox，雖然溶解效果更好，但二甲基亞砜自身有很強(qiáng)的還原性，對(duì)反應(yīng)體系影響較大，所以選用50℃磁力攪拌溶解的方法。體系中不要加入二甲基亞砜。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的選擇

在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，同時(shí)以VC為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，也同樣做平行性、重復(fù)性及穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，將其結(jié)果與Trolox對(duì)比發(fā)現(xiàn)VC的穩(wěn)定性較低。所以選用更穩(wěn)定的Trolox做標(biāo)準(zhǔn)品，這也相應(yīng)地提高了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系。

3.5 試劑的存放時(shí)間

通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試劑放置的時(shí)間不同會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成較大的影響。由于反應(yīng)試劑多是氧化或還原試劑，所以放置時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，基本上要現(xiàn)用現(xiàn)配，這樣可以減小誤差。

3.6 檢測(cè)樣品的濃度

樣品管的吸光度應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍之內(nèi)。若不在此范圍，應(yīng)采用稀釋或濃縮的方法處理后再測(cè)定。但需注意用公式計(jì)算結(jié)果的時(shí)候應(yīng)將稀釋或濃縮倍數(shù)計(jì)算進(jìn)去。

4 結(jié) 論

改良后的鄰二氮菲-Fe2+法具有良好的準(zhǔn)確度(RSD為3.2%)和精密度(RSD為4.4%)；在0.01～0.15g/L Trolox質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有較好的線性關(guān)系；以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)參照物的結(jié)果表達(dá)方式使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具可比性。改良后的鄰二氮菲-Fe2+法適用于保健食品抗氧化能力的檢測(cè)。

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Determination of Antioxidant Capacity of Healthcare Foods by Phenanthroline-Fe2+Method

LIU Wei，WANG Hong-jun，ZHAO Jian，WEN Yue，WEN Jing*
(Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, College of Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Purpose: To develop a phenanthroline-Fe2+method for determining the antioxidant capacity of healthcare foods. Methods: Trolox was used as the

ubstance for antioxidant capacity assessment. Some key determination conditions such as hydrogen peroxide amount, color development time, solvent type, etc were optimized. Method figures of merits including linearity, limit of detection, precision, repeatability and spike recovery were investigated. Results: The developed method presented good linearity when trolox concentration varied from 0.01 to 0.15g/L, with a limit of detection of 0.0050 g/L, a parallel precision (375 ± 12) μmol/g (3.2% variation coefficient), a repeated precision of (365 ± 16) μmol/g (4.4% variation coefficient), and an average spike recovery of (98.0 ± 2.4)% (n = 5). Conclusions: This method is applicable to the determination of antioxidant capacity of healthcare foods.

healthcare foods；antioxidant capacity；phenanthroline- Fe2+method

TS207.3

A

1002-6630(2010)18-0333-05

2010-05-24

北京市教委科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(KM201011417006)；北京市教委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室引導(dǎo)基金項(xiàng)目(21202543503)

劉薇(1986—)，女，助理工程師，學(xué)士，主要從事保健食品功能評(píng)價(jià)研究。E-mial：liuwei4465@sina.com

*通信作者：文鏡(1952—)，男，教授，學(xué)士，主要從事保健食品功能學(xué)評(píng)價(jià)機(jī)理和方法學(xué)研究。E-mail：wenjing@ygi.edu.cn